牛超數排卵技術研究進展

趙振陽，許曉玲，白佳樺，肖霖力，秦玉圣，劉 彥，楊 凌

（1.河北工程大學，河北邯鄲 056000；2.北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 100097）

家畜胚胎移植技術（Embryo transfer，ET）是指將家畜的受精卵或早期胚胎取出移植到同種動物的另一母體內，使之繼續發育為胎兒的技術。該技術有助于縮短世代間隔，可高速、有效地深挖與擴散優良個體的優秀基因，從而促使優秀個體被最大程度地擴繁和利用。牛胚胎移植技術經過數十載的發展，日漸成熟，被廣泛的應用在了實際的繁殖生產，成為新品種培育和良種快速擴繁的重要技術手段[1-4]。牛胎移植技術是一個從供體牛經超排處理后收集胚胎，移植到相同生理狀態下受體牛子宮，最后到完成受孕產犢的過程，包含供體牛超排處理、人工授精、胚胎的回收和受體選擇、同期處理和胚胎移植。胚胎移植過程中最關鍵的問題就是，供體牛體內產生多個成熟的卵泡，而不是正常的只去產生一個，體內產生的胚胎最終可以轉移到受體牛體內進行妊娠。為了獲得大量可轉移的胚胎，超數排卵的步驟則是至關重要的。

目前，在牛胚胎移植中，胚胎主要來自超數排卵后第7 天非手術法獲取的供體母牛[5]。盡管科研人員已對牛超排方案進行了深入研究，但是自牛胚胎移植技術成功以來，每次超排處理后，回收的平均可用胚胎數并不高，約1/3 的供體母牛存在較差的超排反應，并且相同的方案處理不同的個體效果差異顯著[6,7]。實際生產中，約64%的供體生產的可用胚數達不到平均水平[8]，甚至有15%左右的供體不能生產出可用胚胎[9]。超排反應的不確定性提高了牛體內胚胎生產的成本，限制了該技術在生產中的應用效率。因此，本文就牛卵泡發育規律、超排所用激素種類、經典的超排處理方案和效果，以及影響因素等進行簡單敘述，以期為牛體內胚胎高效生產提供技術支持。

1 卵泡發育

1.1 發情周期卵泡發育

在下丘腦-垂體-卵巢軸相關聯的激素作用下，卵巢卵泡和黃體交替發育。促卵泡素（Follicle-stimulating hormon，FSH）會促進小有腔卵泡的生長和發育，在促黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）的刺激下，1～2 個優勢卵泡會形成并排卵。此后，顆粒細胞和內膜細胞等形成黃體，分泌孕酮（Progestational，P4）。牛是單胎動物，所以通常情況下發情時只有一個卵泡發育可以形成優勢卵泡。但事實上，大于95%的母牛在一個發情周期有2～3 個卵泡波[10]。自然狀態下，大概有70%的母牛在一個發情周期中有兩個卵泡波，分別從發情周期第2 天和第9～10 天開始；大約有30%的母牛在一個發情周期有3 個卵泡波，分別從發情周期第2、8～9 和15～16 天開始[11]。不過，無論母牛發情期中有幾個卵泡波，只有在母牛發情時的卵泡波才會形成優勢卵泡并排卵，其他的都會在不同階段閉鎖、退化[12]。

1.2 卵泡發育的激素調節

原始卵泡庫中的腔前卵泡是通過自分泌和旁分泌調節進行募集和發育成有腔卵泡的，促性腺激素影響腔前卵泡的發育速度。進入卵泡發育庫后在促性腺激素作用下發育成小的有腔卵泡[13]，當卵泡大于4mm 以后，它就完全依賴促性腺激素進行后期發育了。有腔卵泡在FSH 的作用下繼續發育形成優勢卵泡，2～3d 后發育為排卵卵泡，并在LH 脈沖式分泌的條件下排卵。當卵泡直徑發育到大于8mm 時，雌激素(Estrogen，E2）的合成與分泌激增，增強了該卵泡對促性腺激素和營養物質的攝取能力，從而抑制其他卵泡發育。

排卵后，卵泡內顆粒細胞和內膜細胞受到LH 刺激發生黃體化，開始泌P4。此時，P4負反饋機制阻礙了下丘腦促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）和垂體FSH、LH 的合成與分泌。如果母牛發情后未進行參配或者配種后沒有受孕，在情期的第16 天左右，子宮將會合成和分泌前列腺素（Prostaglandin，PG），溶解黃體細胞。此時，血液中P4水平下降，其對下丘腦GnRH 和垂體FSH、LH 的合成和分泌的抑制作用解除，下一波卵泡發育開始，母牛進入下一個發情周期[14]。

2 超數排卵

超數排卵是指在雌性動物正常的發情周期中，通過使用外源促性腺激素誘導卵巢內較多的卵泡發育并排卵的技術。20 世紀50 年代后期至60 年代初期，美國農業部、康奈爾大學和威斯康星大學等機構就開始了牛羊超數排卵的研究，當時使用的激素是馬絨毛膜促性腺激素（Equine chorionic gonadotropin，eCG），也就是妊娠母馬的血清促性腺激素（PMSG）[15]。隨后幾十年，研究人員開始探尋超數排卵的激素方案。誘導超數排卵的激素種類很多，最常用的是各種家畜的垂體提取物（FSH，LH），馬絨毛膜促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin，HCG）。超數排卵的有效性取決于所使用的促性腺激素的類型、給藥期、總劑量以及多次給藥時它的減少程度。

2.1 牛超排中常用的生殖激素

2.1.1 促卵泡素

促卵泡素是由動物垂體前葉細胞分泌的糖蛋白激素，其分子是由非共價鍵結合的α 和β 兩個亞基組成的異質二聚體。FSH 的主要作用包括刺激卵泡的生長發育，卵泡顆粒細胞E2合成和分泌以及LH 受體的表達，刺激卵泡膜細胞上LH 受體產生。研究表明，不同動物體FSH 的半衰期并不相同[16]。FSH 超排處理供體牛的效果相對其他激素更加穩定，因此，目前世界上牛胚胎移植的生產實踐中更多的使用FSH 去處理供體牛生產胚胎。由于FSH 在供體牛體內的半衰期僅有5h 左右，所以，在超排程序中必須連續注射，每天2次，持續4d，以確保供體牛血液中FSH 濃度保持穩定，維持正常的超數排卵所需的水平。

2.1.2 促黃體生成素

促黃體生成素是由動物垂體前葉細胞分泌的糖蛋白激素，在公畜體內又稱促間質細胞素（ICSH），由α 和β 兩個亞基組成。LH 與FSH α 亞基的相對分子質量相等，并且兩者可以相互交換，所以一般認為LH 和FSH 的作用與β 亞基有關。LH 與FSH 共同促進卵泡的生長發育、成熟，同時促進卵泡內膜雌激素分泌。在排卵過程中，LH 起主導作用，并促使卵泡破裂后，黃體的形成和孕酮分泌。除此之外，LH 還能促進睪丸間質細胞的成熟和睪酮分泌，以及精子成熟。在現有的商品FSH 中，通常都會添加一定比例的LH，FSH 和LH 兩者配伍使用效果更好。

2.1.3 促性腺激素釋放激素

促性腺激素釋放激素是一種由下丘腦合成和分泌的激素，其主要作用是促進垂體前葉LH 和FSH 的合成與分泌。有研究指出，GnRH 能夠誘導卵泡發育和排卵。處理1.5～2d 后，將會出現一個新的卵泡波。只有卵泡波存在時，GnRH 才會誘導排卵[17]。在發情周期的任意時間使用GnRH，可以使44%～55%的奶牛[18]和60%的肉母牛排卵[18]。

2.1.4 孕酮

孕酮是一種類固醇激素，主要來源于卵巢的黃體細胞。此外，腎上腺、卵泡顆粒細胞和胎盤也分泌孕酮。睪丸也分泌少量的孕酮，主要是雄激素合成過程的中間產物。在妊娠期間，P4扮演著非常重要的角色。它作用于子宮黏膜，促進并維持其增長以及刺激子宮腺的增長和分泌功能，這為后期胚胎的著床和發育創造了必要的條件。此外，P4還可以促進子宮頸收縮、削弱子宮肌肉的蠕動和降低孕期子宮的興奮性，從而維持妊娠。在實際應用中，P4主要被制成孕激素陰道海綿栓或孕激素陰道Y 型栓這兩種產品。這些產品被廣泛應用于動物生產中，以幫助維持妊娠和促進動物的繁殖。

2.1.5 前列腺素

前列腺素是一類存在于動物和人體中的不飽和脂肪酸組成的、具有多種生理作用的活性物質，目前已發現的種類有幾十種。精囊腺是PG產生最多的一個部位，其次是腎髓質、肺和胃腸道。此外，腦、腎上腺、脂肪組織等也合成比較多的PG。PG 還存在于卵巢、子宮內膜、胎盤以及精液、睪丸等。PG 的作用廣泛，在不同組織中即使是同種PG 也有不同功能。PGF 對黃體有明顯的溶解作用，PGE1可以抑制排卵，PGE2α則可以使血液中的LH 水平上升從而促進排卵；PGE1和PGE2都可以促進垂體LH 和FSH 的釋放，但是PGE2的作用更大。除此之外，某些PG還能刺激子宮平滑肌收縮、促進胎盤和惡露排出的作用。

2.1.6 馬屬動物絨毛膜促性腺激素

馬屬動物絨毛膜促性腺激素，最早是從妊娠母馬血液中獲得的一種糖蛋白質激素，因此也叫孕馬血清促性腺激素。eCG 是由妊娠40～150d的馬屬動物子宮內膜杯組織細胞合成并分泌，它由α 和β 亞基組成，兼備了FSH 和LH 共同的生理功能。研究者們將eCG 應用到了牛超數排卵上，通過注射eCG，可以增加牛體內FSH 和LH的水平，促進卵泡發育和成熟，同時也增加黃體體積和孕酮的分泌，為妊娠創造了更好的環境。除了對牛的繁殖有幫助外，eCG 還被廣泛應用于其他動物的繁殖中，例如羊、豬、驢、兔等。

2.2 經典的牛超排方案

2.2.1 CIDR+FSH+PG

⑴對和牛的處理情況和效果

在89 頭供體和牛發情周期上的任意一天早上埋植CIDR（第0 天），第5 天開始FSH（Folltropin-V，400mg NIH/ 瓶，20mL 生理鹽水稀釋）處理。FSH 連續處理4d，分為每天早上8:00，晚上20:00 2 次，每天遞減（2、1.5、1、0.5mL）肌肉注射的方法。第7 天打FSH 同時肌注0.6mg PG，在第二次打完PG 后撤栓。第9 天觀察發情，發情12h 后輸精，間隔12h 再次輸精。每次輸1 支凍精，輸到子宮體前端，最后一次輸精后第7 天采用非手術法沖胚。結果顯示：該處理超排有效率為85.4%，平均回收胚胎數12.0 枚，平均可用胚胎數8.7 枚[19]。

⑵對雷瓊牛的處理情況和效果

在10 頭雷瓊牛供體牛發情周期上的任意一天早上埋植CIDR（第0 天），第9 天開始FSH 處理。采用4 天8 次(早上7:00，晚上19:00)遞減肌肉注射FSH（4、3、2 和1 AU）的方法處理。在第11 天上午注射FSH 同時肌肉注射0.6mg PG，第12 天上午注射FSH 同時撤去CIDR。第13 天早晚觀察母牛發情，觀察到發情后的12h 進行輸精，隔10～12h 再次輸精，連續輸精2～3 次。埋植CIDR 和配種時注射維生素A、維生素D、維生素E 注射液5mL，配種時注射2 支促排3號。結果顯示：該方案處理雷瓊牛，每頭平均回收卵數為8.9 枚，平均有效胚數為4.1 枚[20]。

2.2.2 PG+FSH+PG

（1）對比利時牛的處理情況和效果

在10 頭比利時牛供體牛發情周期中的任意一天肌注PGF2α5mL，11d 后重復注射PGF2α5mL，第二次打完PGF2α后觀察發情（發情當天計為第0 天），第9 天進行超排處理。按4 天8次遞減法注射FSH，第11 天注射FSH 每頭牛同時注射5mL PGF2α。第13 天早晚觀察發情，發情后的10h 給予第一次輸精，6h 后重復輸精，每頭牛輸精2～3 次，每次輸2 支凍精。結果顯示：該處理超排有效率為90.00%，平均回收胚胎數5.33 枚，平均可用胚胎數3.44 枚[21]。

（2）對和牛的處理情況和效果

對7 頭和牛供體牛肌肉注射0.4mg PG，10d后再次肌注0.4mg PG。第11d 開始連續4d 8 次（早上7:00，晚上19:00）遞減肌注FSH（3、2.5、2、1mL）（Folltropin-V，400mg NIH/ 瓶，20mL生理鹽水稀釋），在第13 天晚上和第14 天早上肌注FSH 同時，每頭牛肌注0.4mg PG。第15 天晚上給予第1 次輸精，第16 天中午給予第2 次輸精，輸精同時每頭牛注射25μg 促排3 號，第二次輸精后第7 天沖胚。結果顯示：該處理和牛超排有效率為100.00%，平均回收胚胎數11.29枚，平均可用胚胎數5.89 枚[22]。

2.2.3 CIDR+GnRH+FSH+PG

（1）對和牛的處理情況和效果

在10 頭和牛供體牛確認自然發情排卵后陰道內放置CIDR（第0 天），第7 天肌肉注射GnRH 100mg；間隔3d 后（第10 天）應用FSH 20U 用生理鹽水稀釋后，分3d 減量注射，在第12 天最后一次注射FSH 的同時，取出CIDR，注射PG 誘發排卵；2d 后出現發情（第14 天），并輸精一支精液，第21 天沖胚。結果顯示：該處理直檢黃體數共115 個，回收胚胎88 枚，平均每頭8.8 枚，回收率77%，其中受精卵62 枚，受精率70.45%[23]。

（2）對荷斯坦奶牛的處理情況和效果

對18 頭荷斯坦奶牛供體牛進行B 超檢查，在發情周期第8 天確認供體牛卵巢黃體存在時注射2mL GnRH，同時陰道內放置1.38g 孕酮CIDR。從第11～14 天開始，給予總量400mg FSH，連續4d 早晚間隔12h 8 次遞減處理（70、60、40 和30mg）。第13 天早晚注射2mL 前列腺素2 次，第14 天撤去CIDR，第15 天，給 藥2mLGnRH。在確認發情后，對發情的奶牛使用牛性控精液輸精2 次（間隔12 小時）。在第22 天（人工授精后第7 天）通過非手術沖洗收集胚胎。結果顯示：該處理平均回收胚胎數11.50 枚，平均可用胚胎數6.86[24]。

3 影響超排效果的因素

超排效果是指供體對外源促性腺激素的反應能力，卵巢卵泡發育情況、卵泡數量、卵泡大小、排卵情況、排卵后黃體的數量、回收胚胎數量和可用胚數量是影響超排效果的主要客觀表現。影響牛超排效果的因素眾多且復雜，這包括了供體牛的自身因素和外部因素。

供體牛自身因素主要與超排時牛年齡與胎次、生產性能、發情狀態和卵巢機能、體況和健康狀況等；外部因素主要有供體牛飼糧水平與管理方式、激素類別與來源和注射方式與劑量、環境與季節、超排處理程序、精液品質、沖胚方法和沖胚人員技術等。

日常飼養管理中，牛易受到驚嚇、頂架以及飼糧變化等外界刺激的影響，因此，供體牛應分群管理，飼喂營養均衡的全混合日糧，同時補充足夠的清潔飲水，注重圈舍衛生，以減少飼養過程中對超排效果帶來的負面影響，保證超排工作順利完成。

4 小結

目前我國主要畜種的生產水平與發達國家相比差距明顯。增加良種覆蓋率、提高單產水平是縮小差距的必要手段。利用胚胎工程技術充分挖掘種質資源和繁殖潛力，是大幅加速特色畜種繁育進度的一把利劍。超數排卵技術是家畜胚胎移植技術體系中至關重要的一個環節，該技術已廣泛應用到了牛的繁殖生產中，超排可以一次獲得大量優質卵子，使得優良后代數幾倍的增加甚至幾十倍的增加，大大加快優良品種的擴繁速度。供體牛超排效果不穩定性和不可預測性仍然是制約牛體內胚胎生產的重要因素。在體內胚生產過程中，通過超排技術優化，提高可用胚胎的數量是一個至關重要的過程。因此，如何篩選、優化不同激素超排方案來有效降低生產成本、提高胚胎移植效率，乃至提升優良畜種利用率是目前研究的主要問題，也是今后努力的方向。