錦鯉皰疹病毒胸苷激酶基因的生物信息學分析

陳 莉,周廣彪,鄭耿東,溫爾英,陳文婉,吳松浩,利光輝*

(1.汕頭海關技術中心,廣東汕頭 515041;2.汕頭海關技術中心/汕頭大學理學院水產品聯合實驗室,廣東汕頭 515041;3.汕頭海關動植處,廣東汕頭 515057)

錦鯉皰疹病毒(Koi Herpesvirus,KHV)又稱鯉魚間質性腎炎及鰓壞死性病毒(carp interstitial nephritis and necrosis virus,CNGV),被歸類為皰疹病毒目(Herpesvirales)皰疹病毒科(Herpesviridae)鯉皰疹病毒屬(CyprinidHerpesviridae),該病原被我國列入動物疫病病種名錄中的二類疾病,世界動物衛生組織(WOAH)也將其列為必須申報的動物疫病之一[1-4]。錦鯉皰疹病毒是一種dsDNA皰疹病毒的病原體,它是由31種病毒粒子多肽和8種糖基化蛋白組成,成熟的病毒粒子包含一個松散的包膜,病毒粒子總直徑為170～230 nm,具有一個線性雙鏈DNA基因組[5-8]。Aoki等[9]描述了錦鯉皰疹病毒的全基因組序列,并鑒定了156個獨特的蛋白質編碼基因,為后續科學研究奠定基礎。魚類感染錦鯉皰疹病毒,最明顯的特征之一是鰓弓內血管充血,鰓耙變細,其次該病易發生在腎,腎小管周圍出現炎性浸潤,并伴隨血管充血;發病中后期,病魚行動緩慢,魚眼嚴重凹陷,一般情況下,錦鯉患病死亡率高達90%～100%,因此應引起各國高度重視[10-14]。有研究表明,皰疹病毒增殖的主要毒力基因是胸苷激酶基因[15],胸苷激酶基因編碼胸苷激酶,該酶可將核苷類似物無毒性抗病毒物丙氧鳥苷磷酸化為一磷酸化形式,繼而在細胞的一磷酸鳥苷激酶或細胞內其他激酶的作用下形成二磷酸化產物和三磷酸化產物,三磷酸化產物能整合到細胞DNA上,抑制DNA聚合酶的活性,從而抑制蛋白的合成,阻斷DNA的合成,使分裂細胞被殺傷。錦鯉皰疹病毒中ORF140基因編碼胸苷激酶,是致病基因中的一種,在病毒吸附、穿入、復制合成及細胞中發揮重要作用[16]。

生物信息學(Bioinformatics)是隨著人類基因組計劃發展而不斷發展的一門聯合計算機和信息科學中的技術、方法[17-18]。生物信息學在分子生物學領域取得重大進步,加上基因組技術的進步,突顯生物信息學的重要性。隨著一代測序、二代測序及三代測序的快速發展,測序成本不斷降低,促使更全面、更深入地對基因組進行分析。目前基于生物信息學的方法多種多樣,筆者通過相關軟件對錦鯉皰疹病毒胸苷激酶基因進行生物信息學分析,以期為錦鯉皰疹病毒的分子生物學研究提供方向,為下一步研究的開展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 序列信息錦鯉皰疹病毒(KHV)登錄號:DQ177346.1,可由登錄號在NCBI中查閱完整基因序列。胸苷激酶基因(登錄號:AB375391)是編碼其中一段以ATG為起始密碼子,在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB375391)中可以查看TK基因的完整基因序列。

1.2 方法

1.2.1BioXM基因序列的組成分析。BioXM是進行DNA序列的常規分析,包括ORF查找、序列格式化、翻譯、限制酶切位點分析等功能,通過對基因組分析,確定序列的基本信息。利用NCBI數據網站獲得TK基因的序列,以FASTA格式保存至相關文件夾。將TK基因序列運行至BioXM軟件中,獲得核酸序列的組成分析。

1.2.2TK蛋白質理化性質分析、親/疏水性、信號肽及跨膜區預測。根據TK基因登錄號,從NCBI中獲得的TK基因序列,利用NCBI ORF Finder軟件尋找序列中潛在開放閱讀框(open reading fraction,ORF),并獲得TK基因的氨基酸序列。通過獲取的氨基酸序列和在線軟件Expasy進行蛋白質的理化性質分析,將獲得蛋白質的一般信息;使用在線分析軟件ProtScale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam)預測TK蛋白的親水性和疏水性;利用在線分析軟件TMHMM server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)和SignalP sever(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP)預測TK蛋白的信號肽和跨膜結構,獲得相關數據。

1.2.3TK蛋白結構域分析。利用在線軟件NCBI-CDD分析TK蛋白的結構域,并結合HMMER和SMART對TK蛋白同時進行預測。

1.2.4TK蛋白的二級結構和三級結構預測。利用SOPMA軟件對已獲得的氨基酸序列進行蛋白質二級結構預測的綜合分析。根據SWISS-MODEL軟件進行蛋白質三級結構預測,為豐富TK基因的蛋白數據提供支持。

1.2.5利用MEGA構建蛋白系統發育樹。從數據庫中獲得不同病毒中TK蛋白的氨基酸系列,利用MEGA6軟件的NJ法構建蛋白質系統進化樹,分析親緣關系。

2 結果與分析

2.1 TK基因序列的組成根據TK基因登錄號,從NCBI數據網站獲得TK基因序列,將序列輸入BioXM軟件,可知TK基因序列長度224 bp,其中腺嘌呤核苷酸(A)共24個,占10.71%;鳥嘌呤核苷酸(G)共15個,占總核苷酸序列6.70%;胞嘧啶核苷酸(C)共8個,占總核苷酸序列3.57%;胸腺嘧啶核苷酸(T)共9個,占總核苷酸序列4.02%;其中腺嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶占14.73%,較鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸(10.27%)少4.46%,TK基因分子量為17 378 Da。

2.2 TK蛋白質理化性質預測分析TK基因共編碼224個氨基酸,編碼蛋白質的分子質量為24 623.70 Da,蛋白質的等電點(pI)值為6.31,其中氨基酸的組成見表1。該蛋白中含量前4的為丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和脯氨酸,占比分別為10.7%、9.4%、8.0%和8.0%。酸性氨基酸總數為(Asp+Glu)23,堿性氨基酸總數為(Arg+Lys)22,分子式為C1096H1733N289O316S19,原子總數為3 453。由TK基因編碼的蛋白質不含任何色氨酸殘基,表明這可能導致計算的消光系數約有10%以上的誤差。不穩定系數為44.11,其中不穩定系數大于40,則表示該蛋白不穩定;脂肪指數為84.91,總平均親水性為0.030。通過ProtScale軟件分析結果可知,縱坐標越大,蛋白疏水性就越強。如圖1所示,在氨基酸序列第45個位點,親水性最高;在第5個位點,TK蛋白的疏水性得分最高,綜合理化性質分析,說明該蛋白為親水蛋白。SignaIP是一個信號肽預測服務器,它的功能是預測給定的氨基酸序列中是否存在潛在的信號肽剪切位點及其所在位置。如圖2所示,每個氨基酸對應1個S值,信號肽區域的S值較高;同時每個氨基酸有1個C值,在剪切位點的C值是最高的。綜合考慮S值、C值、Y值,該蛋白不含有信號肽。蛋白結構決定蛋白功能,利用生物學軟件工具TMHMM Server來預測蛋白質跨膜螺旋(圖3)。由TMHMM分析結果可知,TK蛋白長度為224,該蛋白不存在跨膜螺旋,同時跨膜螺旋氨基酸殘基數量的期望值遠遠低于18,該蛋白不存在跨膜螺旋和信號肽,且位于膜外。

表1 TK基因編碼蛋白質數量及百分比

圖1 TK蛋白親水性、疏水性預測Fig.1 Predictive analysis of hydrophilicity and hydrophobicity of TK protein

圖2 TK蛋白信號肽預測Fig.2 Predictive analysis of TK protein signal peptide

注:橫坐標表示提交蛋白序列對應的氨基酸殘基序號,縱坐標表示為橫軸上每個氨基酸位于膜內側、膜外側和跨膜螺旋的概率值。圖中藍色線段是位于膜內的結構,紅色線段是位于膜外的結構。Notes:The horizontal coordinates indicate the amino acid residue numbers corresponding to the submitted protein sequences,and the vertical coordinates are the probability values of each amino acid located in the inner membrane,outer membrane and transmembrane helix on the horizontal axis.The blue line segment in the figure is the structure located inside the membrane,and the red line segment is the structure located outside the membrane.

2.3 TK蛋白結構域分析根據NCBI-CDD進行蛋白結構域分析,結果可知,該蛋白有一個TK超家族結構域,在序列中的位置是4-185(圖4a)氨基酸殘基區域,圖4b則為該蛋白結構域區間;其中E值越小隨機性越低,結果在統計學中越顯著。HMMER(圖4c和4d)和SMART(圖4e)結果表明,TK蛋白結構域位于2-175氨基酸殘基區域。綜合分析可知,TK蛋白結構域位于2-175氨基酸殘基區域的可能性較大。

注:a、b.NCBI-CDD蛋白結構域分析及蛋白結構域區間;c、d.HMMER蛋白結構域分析;e.SMART蛋白結構域分析。Note:a,b.NCBI-CDD protein structural domain analysis and protein structural domain interval;c,d.HMMER protein structural domain analysis;e.SMART protein structural domain analysis.

2.4 TK蛋白質二級結構預測分析蛋白質二級結構的預測通常被認為是蛋白結構預測的第1步,二級結構在蛋白質分析、酶活性殘基分析、蛋白結構預測等方面都是不可缺少的。SOPMA在線軟件對TK蛋白進行二級結構分析,結果如圖5所示,在TK蛋白編碼的224個氨基酸中α-螺旋共72個,占32.14%;β-轉角17個,占7.59%;無規則卷曲86個,占38.39%;延伸鏈49個,占比21.88%。

注:藍色.α-螺旋;綠色.β-折疊;黃色.無規則卷曲;紅色.延伸鏈。Note: Blue.α-helix;green.β-fold;yellow.Irregularly curled;red.Extended chain.

2.5 TK蛋白質三級結構預測分析采用同源建模的方法,根據SWISS-MODEL對TK蛋白進行三級結構預測,結果如圖6所示。TK蛋白的序列相似度與布氏錐蟲胸苷激酶(SMTL ID:5fuv.1.A)模板序列較為相似。

圖6 TK蛋白質三級結構預測分析Fig.6 Prediction analysis of tertiary structure of TK protein

2.6 TK蛋白MEGA構建系統發育樹分析利用TK蛋白的氨基酸序列在NCBI進行blast,得到駱駝痘病毒、沙鼠痘病毒、馬痘病毒、鯉科皰疹病毒1、鯉科皰疹病毒2、鯉科皰疹病毒3、牛痘病毒、火雞痘病毒和斑馬魚病毒等的TK蛋白序列,與錦鯉皰疹病毒氨基酸進行同源序列比對分析,表明錦鯉皰疹病毒TK氨基酸序列與鯉科皰疹病毒親緣關系較近(圖7)。

圖7 TK蛋白系統發育樹分析結果Fig.7 Results of TK protein phylogenetic tree analysis

3 結論

隨著生物學技術的不斷發展提高,生物信息學的應用也逐漸豐富[19]。胸苷激酶基因是大多數皰疹病毒的主要毒力基因之一,也是病毒復制的非必需基因,胸苷激酶蛋白是皰疹病毒中一種高度保守性蛋白,且具有較高的抗原性[20]。前人研究表明,胸苷激酶是DNA合成的關鍵酶之一,痘病毒在復制過程中需要借助胸苷激酶作用形成高濃度核酸以完成子代的順利復制[21]。胸苷激酶基因是豬偽狂犬病病毒的主要毒力基因和非必需基因,也是病毒化學治療和缺失致弱疫苗的主要靶基因[22],因此對TK基因的生物信息學分析,在一定程度上為各種病毒的研究提供了科學基礎。

錦鯉皰疹病毒病是我國農業農村部規定的二類傳染病,目前針對該病毒的研究主要集中在檢測方面。該研究進行了相關基因的生物信息學預測,為今后的研究方向提供基礎。綜合表明,錦鯉皰疹病毒中胸苷激酶基因編碼的蛋白是不穩定蛋白,理化性質分析該蛋白為親水蛋白、不含有信號肽;其蛋白結構域位于2-175氨基酸殘基區域內;該蛋白二級結構主要為無規則卷曲和α-螺旋。綜上,錦鯉皰疹病毒胸苷激酶基因的生物信息學分析為進一步挖掘該基因的功能提供了理論基礎。