清胰化瘀通腑方治療急性胰腺炎作用機制的網絡藥理學和分子對接研究*

蔡銳娜 陳 乾 趙 哲 胡仕祥△

（1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450008；2.河南省中醫院，河南中醫藥大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450002）

急性胰腺炎（AP）是臨床常見急腹癥［1］，AP 發病急，進展快，常呈自限性，但仍有約20%～30%的患者雖積極治療發展為單個或多臟器功能障礙，其中死亡率可高達30%～50%［2-3］，嚴重威脅人類的健康。近年來的臨床實踐與基礎研究發現［4-6］，中醫藥對AP 的治療具有獨特優勢，西醫常規治療與中醫藥并用的中西醫結合治療能取得滿意的臨床療效。

課題組根據臨床治療AP的經驗，總結出中藥復方清胰化瘀通腑湯，組方：生大黃10 g（后下），茵陳蒿15 g，芒硝10 g（沖），桃仁10 g，柴胡10 g，厚樸10 g，木香5 g，丹參10 g，紅花10 g，延胡索15 g，金銀花10 g，連翹10 g。以清熱利濕、化瘀通腑為法，應用于臨床能有效減輕AP患者不同嚴重程度的炎癥反應，促進患者臨床癥狀恢復。但其治療AP 的機制因復方成分復雜無法全面闡述，本研究運用網絡藥理學來探討清胰化瘀通腑方治療AP的主要成分及靶點，并利用分子對接技術進行驗證，為后續更深層次地探討清胰化瘀通腑方的主要調控靶點及作用機制提供一定的理論基礎?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 清胰化瘀通腑方活性成分的篩選和靶點預測 將清胰化瘀通腑方中的藥物輸入到中醫藥系統藥理學數據庫分析平臺TCMSP［7］中，篩選條件設置為口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18［8］，從而獲得藥物活性成分，并根據已有文獻報道對篩選結果進行補充，避免遺漏。將藥物活性成分導入Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中得到對應的SMILES，再通過SwissTargetPrediction［9］數據庫將物種限定為“Homo sapiens”，對清胰化瘀通腑方活性成分進行潛在靶點預測（因TCMSP 中沒有礦石類中藥，故用BATMAN-TCM［10］數據庫補充篩選芒硝的活性成分及靶點）。對上述結果匯總去重并通過UniProt（https：//www.uniprot.org/）數據庫對靶點信息進行規范，獲得清胰化瘀通腑方活性成分的潛在靶點。

1.2 AP 疾病靶基因的篩選 以“AcutePancreatitis”為關鍵詞在GeneCards［11］、DrugBank［12］、OMIM［13］、TTD［14］疾病數據中檢索AP 的潛在靶點，將4 個疾病數據庫得到的靶點匯總去重后得到AP 靶點。將清胰化瘀通腑方潛在靶點與AP 靶點輸入Venny 在線軟件，繪制韋恩圖獲取清胰化瘀通腑方-AP 交集靶點，得到的交集靶點即為清胰化瘀通腑方治療AP的作用靶點。

1.3 PPI網絡的構建與關鍵靶點的篩選 將清胰化瘀通腑方—急性胰腺炎交集靶點導入STRING 數據庫，按物種為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值“highest confidence”（＞0.9）［15］為檢測條件，剔除游離靶點后得到蛋白互作信息，通過Cytoscape3.7.2 軟件的Network Analyzer 工具分析其網絡拓撲參數，并繪制PPI網絡模型。運用CytoNCA［16］拓撲分析各個節點的屬性值，包括中介中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）、網絡中心性（NC）和局部邊連通性（LAC），選出同時滿足BC、CC、DC、NC、LAC＞中位數的所有節點作為關鍵靶點。

1.4 清胰化瘀通腑方治療AP 的富集分析 將清胰化瘀通腑方治療AP 的作用靶點的基因Symbol 通過Uniprot 數據庫轉換為基因ID，利用R 語言以P≤0.05為篩選條件進行GO和KEGG通路富集分析，并將結果繪制成條形圖和氣泡圖。

1.5 建立清胰化瘀通腑方“藥物-活性成分-作用靶點”調控網絡 通過Cytoscape3.7.2 構建“藥物-活性成分-作用靶點”網絡圖，運用Network Analyzer 工具拓撲分析活性成分和作用靶點，篩選出發揮藥效的核心成分，可供使用的篩選條件包括連接度（Degree）、BC 及CC等。

1.6 分子對接 從PubChem 中下載“藥物-有效成分-作用靶點”拓撲分析排名前5 的核心成分的小分子結構，應用Chem3D 軟件進行優化，并轉換為3D 格式。在PDB 數據庫（http：//www.rcsb.org/）中篩選PPI網絡中拓撲分析排名前5 的核心靶點的蛋白結構，用PyMOL軟件對其脫水并剔除原配體，利用AutoDockTools1.5.6和AutoDock Vina 完成分子對接，對部分對接結果用PyMOL軟件進行可視化。

2 結 果

2.1 清胰化瘀通腑方有效活性成分篩選及靶點獲取 見表1。從TCMSP 中下載大黃、茵陳蒿、桃仁、柴胡、厚樸、木香、丹參、紅花、延胡索、金銀花、連翹中符合OB 值及DL 值篩選條件的所有活性成分，從BATMAN-TCM 數據庫篩選芒硝活性成分，剔除重復值后剩余230 個活性成分。將柴胡、丹參、紅花成分標記為A，柴胡、紅花、延胡索、金銀花、木香共有成分標記為B，柴胡、紅花、延胡索、連翹、茵陳蒿、金銀花共有成分標記為C，柴胡、紅花、連翹、金銀花共有成分標記為D，柴胡、茵陳蒿共有成分標記為E，大黃、紅花、連翹、桃仁、茵陳蒿、金銀花共有成分標記為F，丹參、紅花共有成分標記為G，丹參、紅花、連翹、金銀花共有成分標記為H，紅花、金銀花共有成分標記為I，連翹、木香共有成分標記為J，連翹、延胡索共有成分標記為K，木香、延胡索共有成分標記為L。通過Swiss Target Prediction預測活性成分的相關靶點（芒硝1 個活性成分的相關靶點通過BATMAN-TCM 數據庫補充），對結果匯總去重后剩余734個靶點。

表1 藥物中存在的共有活性成分

2.2 AP 相關靶點的預測 見圖1。從Genecards、DrugBank、OMIM、TTD 疾病數據庫得到AP 靶點個數分別為9 072、6、185、6，匯總去重后得到AP 相關靶點1 269 個。將2.1 得到的清胰化瘀通腑方潛在靶點與AP 靶點輸入Venny 在線工具，繪制韋恩圖，并獲取清胰化瘀通腑方-AP交集靶點179個。

圖1 清胰化瘀方通腑方-AP交集靶點韋恩圖

2.3 PPI 的構建與核心靶點的篩選 見圖2、表2。將清胰化瘀通腑方-AP交集靶點輸入STRING數據庫，剔除25個游離靶點后得到蛋白互作信息，將其導入Cytoscape3.7.2 軟件，PPI 網絡模型見圖2A，圖中共154 個節點，723 條邊，節點面積越大、顏色越深Degree 值越高，邊越粗相關性越強。經CytoNCA 計算網絡中各個節點的屬性值，并按中位數進行2 次篩選，得到包括STAT3、PIK3R1、PIK3CA、RHOA、RAC1 等14 個靶點，見圖2B，靶點的拓撲分析參數見表2。這些靶點節點大、顏色深，相關性強，可能在清胰化瘀通腑方治療AP中發揮關鍵作用。

圖2 PPI蛋白互作網絡和核心靶點

表2 清胰化瘀通腑方作用AP核心靶點的網絡節點特征參數

2.4 GO和KEGG通路富集分析 見圖3、圖4。將179個作用靶點的Uniprot 號通過Uniprot 數據庫轉換為entrez 號，然后利用R 語言根據P≤0.05 對GO 的BP（biological process）、CC（celluar component）、MF（molecular function）及KEGG 通路進行富集分析。清胰化瘀通腑方參與的BP 條目主要包含肽基-酪氨酸磷酸化、肽基-酪氨酸修飾和激酶活性的正向調節等2 398 個；CC 條目主要包含膜筏、膜微區、黏著斑等89 個；MF 條目主要包含蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、內肽酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性等184 個。根據P 值分別選取BP、CC、MF 排名前10 的生物過程繪制條形圖。清胰化瘀通腑方參與的通路主要包括PI3K-Akt、脂質和動脈粥樣硬化、癌癥中蛋白多糖等169 條，選取P 值排名前20的通路繪制氣泡圖。

圖3 清胰化瘀通腑方治療AP的GO分析

圖4 清胰化瘀通腑方治療AP的KEGG分析

2.5 清胰化瘀通腑方“藥物-活性成分-作用靶點”調控網絡的構建 見表3、圖5。將藥物、活性成分及清胰化瘀通腑方治療AP 的作用靶點輸入CytoScape3.7.2中，得到“藥物-活性成分-作用靶點”網絡圖，并用內置的NetworkAnalyzer 插件分析清胰化瘀通腑方治療AP的網絡拓撲學參數，網絡圖見圖5。圖5由345個節點和2280 條邊組成，其中藥物用圓形節點表示，活性成分以六邊形表示，靶點以菱形表示；面積越大、顏色越深說明Degree 值越大，提示該節點越重要。分析結果表明，槲皮素（quercetin）的Degree 值為32，且為柴胡、紅花、延胡索、連翹、茵陳蒿、金銀花共有成分；山柰酚（kaempferol）的Degree 值為31，且為柴胡、紅花、連翹、金銀花共有成分；木樨草素（luteolin）的Degree值為30，且為丹參、紅花、連翹、金銀花共有成分；氧雜蒽酮（Onjixanthone I）的Degree 值為30；異鼠李素（isorhamnetin）的Degree 值為29，且為柴胡、茵陳蒿共有成分，所以預測這5 種藥物成分可能為清胰化瘀通腑方治療AP的核心成分。

圖5 藥物-活性成分-作用靶點網絡圖

表3 清胰化瘀通腑方核心成分網絡節點特征參數

2.6 分子對接 見圖6、圖7。將清胰化瘀通腑方核心成分quercetin、kaempferol、luteolin、Onjixanthone I 及isorhamnetin 分別與2.3 中PPI 網絡拓撲分析排名前5的核心靶點STAT3、PIK3R1、PIK3CA、RHOA、RAC1 進行分子對接，結合自由能＜-5 kcal/mol，表明受體與配體之間具有良好的結合活性，結合活性結果統計如圖6 所示，熱圖中顏色越紅，代表結合活性越高。并用PyMOL軟件對部分對接結果進行圖片展示。

圖6 核心成分-核心靶點分子對接熱圖

圖7 核心活性成分與核心靶點部分對接

3 討 論

中醫學并無AP之名，但根據其臨床表現及疼痛部位，將其歸屬于“腹痛”“脾心痛”“胰癉”等范疇［17］，胰腺根據其部位，當屬中醫六腑范圍，按照“六腑以通為用，以降為順”的理論，將通里攻下法貫穿本病治療的始終，采用清熱通腑、祛瘀通腑、通腑祛濕等治法，不局限于胰腺局部，而是注重于整體功能的調節，不僅可以針對AP 的病因進行治療，同時可以有效緩解AP 引起的一系列并發癥。近年來的臨床實踐與基礎研究發現，西醫常規治療與中醫藥并用的中西醫結合治療AP能取得滿意的臨床療效［18-20］。

課題組總結多年臨床經驗，綜合各醫家所長，認為AP患者雖然癥狀各異，但其病機相同，皆由飲食不節、外感六淫之邪等，導致脾胃健運失司，氣機升降失常，腑氣不暢，進而逐漸演變成為以熱、濕、瘀、毒等蘊結中焦的病變，因此，在疾病早中晚期，毒瘀互結是其主要病機，“毒”為病機，“瘀”為演變。清胰化瘀通腑方清熱利濕、化瘀通腑，以大黃、芒硝、茵陳蒿、桃仁為君，大黃、芒硝具有瀉熱存陰之功，茵陳蒿清利濕熱、桃仁活血化瘀，四藥共奏通腑泄熱、利濕化瘀、釜底抽薪之效；柴胡、厚樸、木香理氣并助硝黃通腑，丹參、紅花活血化瘀助桃仁解瘀滯共為臣藥；金銀花、連翹助大黃、芒硝清熱解毒、透邪外出，延胡索助桃仁、柴胡活血理氣止痛共為佐使藥。

本研究中網絡藥理學初步篩選出清胰化瘀通腑方治療AP 的活性成分主要包括槲皮素、山柰酚、木樨草素、氧雜蒽酮、異鼠李素等，且部分活性成分多味藥物的重復成分，如槲皮素重復6 次，山柰酚、木犀草素重復4 次，異鼠李素重復2 次。研究顯示，槲皮素是一類對炎癥預防有積極作用的黃酮化合物，調節各種參與致癌和信號轉導途徑的蛋白，可通過上調miR-216b來抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及p38/MAPK 信號通路從而對AP 具有保護作用［21］，并抑制表皮生長因子誘導的胰腺癌細胞的遷移活性［22］。山柰酚可抑制NFκB 信號通路的激活來減少炎癥因子的產生，減輕AP的炎癥反應，改善AP 預后［23］，也以劑量依賴的方式抑制人胰腺癌細胞（PANC-1）增值及NF-κB、血管內皮細胞生長因子（VEGF）蛋白表達水平而誘導胰腺癌細胞凋亡并抑制其侵襲［24］。木樨草素通過誘導血紅素加氧酶（HO-1）介導的抗炎和抗氧化作用來抑制NFκB 通路的活性、降低脂質過氧化作用、降低TNF-α、丙二醛（MDA）的表達來保護胰腺組織［25-26］，也可通過抑制白細胞介素-6（IL-6）、STAT3 通路、EGFR-ras 通路和SOX9 蛋白，從而抑制因AP 誘導的與胰腺癌關系密切的腺泡導管化生、細胞增殖和上皮-間充質轉化，減緩胰腺炎進展為胰腺癌的過程［27］。異鼠李素可抑制NF-κB 信號通路的活性、減少炎癥因子的釋放來發揮抗炎作用［28］，并可降低Ras/MAPK 通路中MEK 和ERK的磷酸化水平，阻滯胰腺癌細胞系PANC-1 中的細胞生長，從而預防胰腺癌的發生［29］。由此可見，以槲皮素、山柰酚、木樨草素、異鼠李素為代表的活性成分在清胰化瘀通腑方治療AP中發揮了重要作用。

在PPI 蛋白互作網絡中，篩選出清胰化瘀通腑方治療AP的核心靶點主要包括STAT3、PIK3R1、PIK3CA等。胰腺組織中STAT3 的活化與AP 的病變危重程度密切相關［30］，STAT3 在包括胰腺癌在內的多種癌癥中呈現出過表達，并導致腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移［31］，且AP 可激活IL-6 和TNF-α 誘導的STAT3 信號通路，促進炎癥反應、胰腺纖維化和細胞凋亡［32］，導致肺損傷甚至多器官功能障礙［33-35］，抑制STAT3 活性是緩解AP 進展的潛在靶標［35］。PI3K 所參與的PI3K/Akt信號通路可通過調控腺泡細胞的炎癥反應、凋亡、自噬、氧化應激等，對AP 的發生發展及治療起重要作用［36］，而分別編碼PI3K 催化亞基p110α、調節亞基p85α 的PIK3CA 和PIK3R1 均參與PI3K/Akt 通路，兩個基因的功能缺陷均可導致PI3K/Akt 通路異常［37-38］。富集分析作用靶點的結果顯示，清胰化瘀通腑方治療AP 可能通過PI3K/Akt、脂質和動脈粥樣硬化、癌癥中蛋白多糖等信號通路。PI3K/Akt控制著多種信號傳導通路，以往的許多實驗中已證實了其在炎癥反應中的作用，而且它與NF-κB、IL-6 也密切相關［39］，是AP 發生發展過程中的重要信息通路。PI3K 通過影響AP 疾病過程中胰蛋白酶原激活、鈣超載和NF-κB 通路，從而對胰腺腺泡細胞的病理反應進行調控［40］，并通過調節促炎細胞因子密切影響著AP 的嚴重程度［41］。激活PI3K/Akt 下游通路NF-κB 可引起腺泡細胞發生氧化應激反應，并誘導細胞自噬［42］，加強胰腺損傷和壞死程度［43-44］。而抑制PI3K/Akt 信號通路的激活可抑制NF-κB 通路，阻止細胞凋亡，減輕炎癥反應［45-46］，同時阻止活性氧（ROS）的產生，減輕AP 中甲狀腺的損傷［47］。故推測清胰化瘀通腑方可能通過抑制PI3K/Akt 信號通路來治療AP。本研究分子對接結果顯示，槲皮素、山柰酚、木樨草素、異鼠李素與STAT3、PIK3R1、PIK3CA等均具有良好的結合活性。

本研究發現，清胰化瘀通腑方可能通過槲皮素、山柰酚、木樨草素等多種活性成分，調控STAT3、PIK3R1、PIK3CA 等多個靶點，干預PI3K/Akt 等多條信號通路，從抗炎、抗細胞凋亡、抗氧化應激等方面來治療AP，為臨床應用清胰化瘀通腑方治療AP 提供了科學依據。后續將在此基礎上繼續深入研究，進行動物或細胞實驗驗證，更深層次地探討清胰化瘀通腑方的主要調控靶點及作用機制，以期為開發利用中醫藥治療AP提供新思路。