沙苑子總黃酮基于RANK/RANKL/OPG 信號軸抑制MG-63 骨肉瘤細胞生長并促使其凋亡的機制研究*

李 婷 張 旗 汪國友 李東波 何 躍 呂 政 石厚銀 沈驊睿△

（1.西南醫(yī)科大學，四川 瀘州 646000；2.四川省合江縣中醫(yī)醫(yī)院，四川 合江 646000；3.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000；4.四川省康復醫(yī)院，四川 成都 610000；5.成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 610000）

【目的】 目的 觀察沙苑子總黃酮（FAC）基于RANK/RANKL/OPG 信號軸對MG-63 骨肉瘤細胞凋亡的影響。方法 不同濃度FAC、順鉑（陽性對照）作用于MG-63 骨肉瘤細胞后，采用CCK-8 法檢測不同時間點的增殖抑制作用，劃痕實驗檢測細胞遷移修復能力，Hoechest染色、流式細胞術檢測細胞凋亡，PCR和Western blotting檢測細胞RANK、RANKL、OPG 和凋亡相關因子Caspase-3 mRNA 和蛋白表達。結果 CCK-8 法顯示，除50 mg/L FAC 對24、48 h 細胞存活率影響相近（P ＞0.05）外，其余濃度FAC（100、200、300、400 mg/L）均可顯著抑制MG-63 骨肉瘤細胞的增殖（P ＜0.05），并呈一定的時間和濃度依賴性。劃痕實驗顯示FAC 及順鉑對MG-63骨肉瘤細胞的遷移修復能力有抑制作用，并表現(xiàn)出濃度依賴性，低、中、高濃度組（100、200、300 mg/L）遷移修復率分別為（31.62±0.85）%、（25.38±1.18）%、（6.05±2.96）%，陽性對照組（10 mg/L順鉑）為（14.74±2.58）%。Hoechest熒光染色和流式細胞術顯示FAC、順鉑作用48 h可促進MG-63骨肉瘤細胞凋亡。對照組、陽性對照組細胞凋亡率為7.84%、93.61%，低、中、高濃度組凋亡率分別為4.46%、8.51%、98.15%。PCR 顯示FAC和順鉑降低MG-63骨肉瘤細胞OPG 的mRNA 表達，增強RANK、RANKL、Caspase-3 的mRNA 表達。Western blotting 顯示FAC 和順鉑降低MG-63骨肉瘤細胞OPG 蛋白表達水平，上調RANK、RANKL、Caspase-3蛋白表達水平。結論 FAC在體外具有促進MG-63骨肉瘤細胞凋亡作用，300 mg/L FAC促凋亡作用與10 mg/L 順鉑相當，其促凋亡機制可能與RANK/RANKL/OPG 信號軸調控有關。

骨肉瘤是原發(fā)性惡性骨腫瘤［1］，其起源于間葉組織，好發(fā)于兒童和青少年，具有惡性程度高、生長速度快、易早期轉移、預后差等特點［2］。手術、放化療及二者聯(lián)合是目前骨肉瘤的主要治療方法。因為治療方法的革新，1970 年代以來無轉移骨肉瘤患者的5 年生存率提高到約70%［3］。但是30 多年來，骨肉瘤患者的預后沒有顯著變化，特別是初診時就已經(jīng)發(fā)生轉移的患者，其5 年生存率僅約20%［4］。部分患者對化療不敏感、藥物耐藥及腫瘤復發(fā)是目前骨肉瘤治療上的一大難題［5］。

沙苑子是豆科植物扁莖黃芪的干燥成熟種子，黃酮類是沙苑子的主要有效成分［6］。研究表明，沙苑子總黃酮（FAC）具有抗腫瘤、降壓、調脂、促進骨髓間充質干細胞分化等作用［7-12］。本研究以MG-63骨肉瘤細胞為研究對象，在證實FAC 具有抑制其增殖的同時，進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人MG-63 骨肉瘤細胞株購自河南多沃生物科技有限公司，用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基在5% CO2、37 ℃、相對濕度70%～80%的培育箱中培養(yǎng)，細胞密度達瓶底80%～90%時進行傳代或將細胞凍存，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2 藥物及試劑 FAC 由西南醫(yī)科大學藥學院稅丕先教授提取、提供，純度32.07%；Cisplatin3 順鉑（SC5170，北京索萊寶科技有限公司）；25 cm2細胞培養(yǎng)瓶（KG20025，上海科進生物技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（BL521A，合肥蘭杰柯科技有限公司）；CCK8試劑盒（CKD4，日本同仁化學研究所）；Hoechst33258染色液（C0020-10，北京索萊寶科技有限公司）；AnnexinVFITC/PI 細胞凋亡試劑盒（E-CK-A211，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；山羊抗兔二抗-HRP、山羊抗小鼠二抗-HRP（70-GAR0072、70-GAM0072，蘇州螞蟻淘生物科技有限公司）；RNA 提取試劑盒（NO.RE-03014，成都福際生物技術有限公司）；實時熒光定量PCR 試劑盒、逆轉錄試劑盒（MasterMix-ES、G492，鎮(zhèn)江愛必夢生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器 倒置熒光顯微鏡（M152-N，廣州明美光電科技有限公司）；全波長酶標儀（Synergy 2，美國伯騰儀器有限公司）；流式細胞儀（Cyto FLEX，貝克曼庫爾特國際貿易上海有限公司）；高速低溫組織研磨儀（KZ-Ⅲ-F，武漢賽維爾生物科技有限公司）；臺式高速冷凍離心機（D3024R，美國賽洛捷克有限公司）；全自動醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)（SLAN-96S，上海宏石醫(yī)療科技有限公司）；電泳儀、轉膜儀（型號分別為Power Pac Basic、Mini Trans-Blot Cell，美國伯樂生命醫(yī)學產品上海有限公司）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Chemi Scope6100，上海勤翔科學儀器有限公司）。

1.4 CCK8 法檢測FAC 對MG-63 骨肉瘤細胞增殖抑制的影響 取對數(shù)生長期且密度達瓶底80%～90%的MG-63 骨肉瘤細胞，洗滌，消化，離心并重懸，取100 μL 細胞懸液（8×104個/mL）接種到96 孔板中，進行分組：給藥組分別加入濃度為50、100、200、300、400 mg/L 的FAC，對照組加入等體積培養(yǎng)液，為排除藥物及培養(yǎng)液本身對CCK8 比色測定OD 值的可能影響，另設置空白對照組（只含空白培養(yǎng)基），每組5 個復孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，添加100 μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，用酶標儀測定450 nm 波長下的光密度（OD），重復實驗3 次。計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（OD 給藥組-OD 空白對照組）÷（OD 對照組-OD空白對照組）×100%；繪制細胞生存曲線；計算半數(shù)抑制濃度IC（50）。

1.5 劃痕實驗檢測FAC 對MG-63 骨肉瘤細胞遷移修復能力的影響 調整對數(shù)生長期細胞濃度，以4×105個/mL 接種在6 孔板中，每孔接種1 mL，培養(yǎng)至細胞貼壁且長滿板底，在細胞的中央?yún)^(qū)域劃痕，PBS洗滌3次，隨機分為對照組，低、中、高濃度組（100、200、300 mg/L）及陽性對照組（10 mg/L 順鉑），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別在0 h 和24 h 時顯微鏡下鏡檢拍照，重復實驗3 次，用ImageJ軟件計算細胞劃痕面積。

1.6 FAC 對MG-63 骨肉瘤細胞的形態(tài)學影響 調整對數(shù)生長期細胞濃度，以1×105個/mL 接種在24 孔板中，每孔接種0.5 mL，培養(yǎng)至細胞貼壁且長滿板底，同“1.5 項目”分組，每組3 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別于0 h和48 h在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.7 Hoechst33258 染色法檢測細胞凋亡情況 調整對數(shù)生長期細胞濃度，以1×105個/mL 接種在24 孔板中，每孔接種0.5 mL，培養(yǎng)過夜至細胞貼壁，同“1.5”分組，每組3 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，PBS 洗滌2 次，無水甲醇固定3 h，PBS洗滌2次，室溫下Hoechst33258染色液避光染色10 min，PBS 洗滌2 次，熒光顯微鏡下觀察各組細胞凋亡情況。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡 調整對數(shù)生長期細胞濃度，以2×105個/mL 接種在6 孔板中，每孔接種1 mL，培養(yǎng)過夜至細胞貼壁，同“1.5 項目”分組，每組3 個復孔，加藥后培養(yǎng)48 h，收集各組的培養(yǎng)基，以1 000 r/min 離心4 min，去上清液，根據(jù)AnnexinV/PI試劑盒說明處理細胞，1 h內流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.9 RT-PCR 檢測細胞RANK、RANKL、OPG 及凋亡相關因子mRNA 的表達 調整對數(shù)生長期細胞濃度，以2×105個/mL 接種在6 孔板中，每孔接種1 mL，培養(yǎng)過夜至細胞貼壁，同1.5 節(jié)分組，每組3 個復孔，加藥培養(yǎng)48 h后收集各組細胞，按照試劑盒方法提取總RNA，核酸分析儀測定濃度，每個樣本取2 μg RNA，參照試劑盒說明書逆轉錄為cDNA，以β-Actin 為內參，按照試劑盒說明進行PCR 擴增，循環(huán)條件為：95 ℃10 min預變性，（95℃10 s，60 ℃30 s）×40個循環(huán)，目標基因的相對表達量=2-ΔΔCT。引物序列見表1。

表1 RT-PCR中的PCR反應引物

1.10 Western blotting 檢測細胞RANK、RANKL、OPG及凋亡相關因子蛋白表達 調整對數(shù)生長期細胞濃度，以2×105個/mL 接種在6 孔板中，每孔接種1 mL，培養(yǎng)過夜至細胞貼壁，同1.5 節(jié)分組，每組3 個復孔，加藥培養(yǎng)48 h 后收集各組細胞，加入RIPA 裂解液進行裂解，BCA 法測定蛋白濃度，取160 μL 蛋白上清，十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離蛋白后，轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入抗RANK、RANKL、OPG、Caspase-3和β-Actin 的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3次，加入二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL試劑盒顯色，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用Image J軟件分析灰度。

1.11 統(tǒng)計學處理 各檢測結果采用GraphPad Prism8.0.1、SPSS22.0軟件進行分析，計量資料均以（±s）表示，計數(shù)資料均以“n、%”表示，組間差異比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 FAC對MG-63骨肉瘤細胞的增殖抑制作用 CCK8法檢測結果顯示，與對照組相比，50 mg/L FAC 作用24、48 h后細胞存活率較對照組下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），72 h時差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。其余不同濃度組在24、48、72 h 時細胞存活率均下降（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001），且藥物濃度越高、作用時間越長，細胞存活率越低，呈現(xiàn)出明顯的時間和濃度依賴趨勢，給藥24、48、72 h后的IC50分別為（212.200±2.13）、（135.771±25.27）、（61.930±1.26）mg/L，結果見表2、圖1。

圖1 FAC作用MG-63骨肉瘤細胞24、48、72 h時的半數(shù)抑制濃度（IC50）

表2 各組不同時間點骨肉瘤細胞存活率比較（%，±s）

表2 各組不同時間點骨肉瘤細胞存活率比較（%，±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。下同。

組 別對照組FAC 50 mg/L組FAC 100 mg/L組FAC 200 mg/L組FAC 300 mg/L組FAC 400 mg/L組n3 3 3 3 3 3 24 h 100.00±0.27 88.66±6.52 80.94±8.72*68.23±0.38**41.59±18.75***5.37±1.56***48 h 100.00±0.37 85.81±11.00 59.51±13.58**44.86±18.62***20.48±9.84***2.08±0.74***72 h 100.00±0.00 58.00±0.95***29.78±0.44***16.35±1.50***5.57±0.35***1.13±0.53***

2.2 FAC 對MG-63 骨肉瘤細胞遷移修復能力的影響 見圖2、圖3。劃痕實驗結果顯示，對照組細胞劃痕遷移修復率最高，為（42.47±0.78）%，低、中、高濃度組分別為（31.62±0.85）%、（25.38±1.18）%、（6.05±2.96）%，陽性對照組為（14.74±2.58）%。各濃度組、陽性對照組的劃痕遷移修復率較對照組均降低，且劃痕遷移修復率與藥物濃度呈負相關，中、高濃度組及陽性對照組與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），高濃度組較陽性對照組遷移修復率低。

圖2 顯微鏡下不同濃度FAC作用MG-63骨肉瘤細胞0 h和24 h時的遷移修復

圖3 不同濃度FAC作用MG-63骨肉瘤細胞24 h的遷移修復率

2.3 FAC 作用后MG-63 骨肉瘤細胞形態(tài)學變化 見圖4。普通光學顯微鏡下，正常MG-63 骨肉瘤細胞為貼壁細胞，細胞形態(tài)較均一，排列整齊，為成纖維細胞狀。給予FAC 藥物作用48 h 后，細胞狀態(tài)逐漸變差，逐漸皺縮變圓，直至從細胞培養(yǎng)板底部脫落，且細胞皺縮脫落數(shù)量隨著藥物濃度升高而增多，逐漸破裂成細胞碎片。

2.4 FAC 誘導MG-63 骨肉瘤細胞發(fā)生凋亡 見圖5。Hoechst33258 熒光染色結果顯示，對照組細胞核大小相近，染色均勻，呈現(xiàn)均一的藍色淡染。低、中、高濃度FAC 及順鉑作用MG-63 骨肉瘤細胞48 h 后均存在細胞凋亡現(xiàn)象，表現(xiàn)出典型的凋亡細胞細胞核熒光特征，高亮藍色濃染的細胞核，染色質固縮貼近細胞核，細胞核因凋亡而碎裂，并出現(xiàn)凋亡小體，且隨FAC 濃度增高，MG-63 骨肉瘤細胞凋亡現(xiàn)象更明顯，高濃度組較陽性對照組凋亡現(xiàn)象更強。

2.5 FAC 誘導MG-63 骨肉瘤細胞的凋亡率 見圖6、圖7。流式細胞術結果顯示，與對照組、陽性對照組的細胞總凋亡率為7.84%、93.61%相比，低、中、高濃度FAC 作用MG-63 骨肉瘤細胞48 h 時總凋亡率分別為4.46%、8.51%、98.15%，高濃度組較對照組、陽性對照組凋亡率高，與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖6 不同濃度FAC作用48 h后MG-63骨肉瘤細胞凋亡的流式圖

圖7 Annexin V/PI雙染法流式細胞儀檢測不同濃度FAC對MG-63骨肉瘤細胞的誘導凋亡作用

2.6 不同濃度FAC 對MG-63 骨肉瘤細胞中RANK、RANKL、OPG 及凋亡相關因子Caspase-3 mRNA 表達的影響 見表3。RT-PCR 檢測結果顯示，與對照組相比，各濃度給藥組、陽性對照組MG-63 骨肉瘤細胞OPG 的mRNA 表達下降，其中高濃度組與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），高濃度組較陽性對照組表達更低。高濃度組、陽性對照組MG-63 骨肉瘤細胞中RANK、RANKL的mRNA表達升高，高濃度組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。各濃度給藥組、陽性對照組MG-63骨肉瘤細胞中Caspase-3 mRNA 表達明顯升高（P＜0.05或P＜0.001），高濃度組表達較陽性對照組高。

表3 各組MG-63骨肉瘤細胞48 h后RANK、RANKL、OPG及Caspase-3的mRNA表達水平比較（±s）

表3 各組MG-63骨肉瘤細胞48 h后RANK、RANKL、OPG及Caspase-3的mRNA表達水平比較（±s）

組 別對照組低濃度組中濃度組高濃度組陽性對照組n3 3 3 3 3 RANK 1.00±0.12 1.64±0.41 4.19±1.27 16.79±4.67***1.74±0.37 RANKL 1.00±0.25 1.07±0.11 0.91±0.09 4.43±1.38**3.35±1.47 OPG 1.00±0.10 0.66±1.07 0.49±0.17 0.04±0.02***0.14±0.07 Caspase-3 1.00±0.03 1.65±0.36*1.71±0.10*2.94±0.48***1.79±0.29*

2.7 不同濃度FAC 對MG-63 骨肉瘤細胞中RANK、RANKL、OPG 及凋亡相關因子Caspase-3 蛋白表達的影響 見表4、圖8。Western blotting 檢測結果顯示，與對照組相比，各濃度給藥組及陽性對照組MG-63 骨肉瘤細胞中OPG 蛋白表達明顯下調（P＜0.05 或P＜0.01或P＜0.001），高濃度組較陽性對照組表達更低。與對照組相比，各濃度給藥組、陽性對照組MG-63 骨肉瘤細胞中RANK、RANKL 蛋白表達明顯上調（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），高濃度組均較陽性對照組表達水平高。與對照組相比，各濃度給藥組MG-63 骨肉瘤細胞中Caspase-3 蛋白表達上調，中、高濃度組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

圖8 48 h后各組MG-63骨肉瘤細胞RANK、RANKL、OPG及Caspase-3蛋白表達

表4 各組MG-63骨肉瘤細胞48 h后RANK、RANKL、OPG及Caspase-3蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組MG-63骨肉瘤細胞48 h后RANK、RANKL、OPG及Caspase-3蛋白相對表達量比較（±s）

組別對照組低濃度組中濃度組高濃度組陽性對照組n3 3 3 3 3 RANK/β-Actin 0.16±0.04 0.33±0.06*0.61±0.13**0.79±0.12***0.59±0.12**RANKL/β-Actin 0.07±0.01 0.23±0.05**0.53±0.04***0.86±0.03***0.65±0.06***OPG/β-Actin 1.00±0.18 0.65±0.14*0.62±0.13*0.18±0.01***0.48±0.10**Caspase-3/β-Actin 0.14±0.04 0.45±0.05 0.72±0.15*1.11±0.09**0.98±0.07

3 討 論

骨肉瘤是一種普遍且具有浸潤性的骨惡性腫瘤，預后極差。經(jīng)過多次化學治療的骨肉瘤患者往往會產生耐藥，耐藥不僅限于使用過的化療藥物，還會造成其他多種不同化療藥物交叉耐藥，對化療藥物耐藥是骨肉瘤患者治療失敗的主要原因之一［13］。化療作為骨肉瘤患者治療的主要方式之一，耐藥導致的療效不佳是一個亟待解決的問題。現(xiàn)有研究已經(jīng)證明，中藥不僅能調節(jié)惡性腫瘤患者的身體機能，提高免疫力［14］，同時也能有效增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性、逆轉腫瘤細胞化療耐藥、防治腫瘤細胞遠處轉移［15］，部分中藥甚至具有殺傷腫瘤細胞的作用［16］。

《本草衍義》［17］以“補腎藥，今人多用”首次確認沙苑子補腎功效，現(xiàn)今亦認為沙苑子“功專補腎固精”［18］，為“腎臟氣劑”［19］。已證明FAC 可抗白血病、宮頸癌、乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤［20-24］。韋翠萍等［20］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AC可以抑制HL-60細胞增殖，并表現(xiàn)出濃度及時間依賴性，其機制可能是通過提高p53 蛋白表達誘導HL-60 細胞凋亡。劉春宇等［21］實驗發(fā)現(xiàn)，無論體內體外，F(xiàn)AC 對HL-60、SMMC-7721 和HeLa 細胞均有明顯的抑制作用。胡延維等［22］證實，F(xiàn)AC 可通過下調VEGF及其受體的表達，上調ES的表達，抑制腫瘤組織血管生成，進而產生抗腫瘤作用。已證實FAC 通過誘導細胞凋亡、抑制血管生成等途徑實現(xiàn)抗腫瘤作用，但其具體作用機制尚未完全闡明。

本實驗通過采用不同濃度FAC 體外作用于MG-63骨肉瘤細胞，發(fā)現(xiàn)FAC可以抑制MG-63骨肉瘤細胞的增殖，但低濃度、短時間的抑制作用較弱，當達到一定濃度后（本實驗提示為100 mg/L）FAC 對MG-63 骨肉瘤細胞具有明顯的抑制作用，且細胞存活率與濃度呈負相關。劃痕實驗顯示200、300 mg/L FAC 可明顯抑制MG-63 骨肉瘤細胞的遷移和修復，且300 mg/L FAC 的抑制作用較10 mg/L 順鉑強。FAC 藥物作用后，細胞失去了原有的成纖維細胞狀形態(tài)，貼壁黏附力下降，破裂成細胞碎片，在大體上呈現(xiàn)出凋亡形態(tài)。Hoechst33258 熒光染色顯示FAC 作用48 h 后MG-63骨肉瘤細胞表現(xiàn)出凋亡形態(tài)學變化，且隨FAC 濃度增高，MG-63骨肉瘤細胞凋亡現(xiàn)象更明顯，300 mg/L FAC較10 mg/L 順鉑凋亡現(xiàn)象明顯。流式細胞儀檢測Annexin V-PI 雙染結果顯示，300 mg/L FAC、10 mg/L 順鉑作用48 h 能明顯誘導MG-63 骨肉瘤細胞發(fā)生凋亡，300 mg/L FAC較順鉑凋亡率高。

為了進一步研究FAC 誘導MG-63 骨肉瘤細胞凋亡的具體機制，本研究用PCR 法和Western blotting 法檢測細胞RANK、RANKL、OPG、Caspase-3 的mRNA 和蛋白表達。Caspase 是細胞凋亡途徑的關鍵因素［25］。RANK 是TNF 受體配體超家族成員，其配體是腫瘤壞死因子（TNF）配體超家族的RANKL，它們在破骨細胞分化、活化、成熟過程中起關鍵作用。OPG屬于TNF受體超家族成員，是一種“圈套”受體，其與配體RANKL結合可阻斷RANKL／RANK 間的相互作用，從而起到抑制破骨細胞分化、減少骨吸收的作用［26］。PCR 結果顯示，F(xiàn)AC 作用后細胞的Caspase-3 mRNA 表達升高，RANKL 和RANK mRNA 表達也升高；相反，OPG mRNA 表達下降。Western blotting 結果顯示，F(xiàn)AC作用后細胞的RANK、RANKL 和Caspase-3 蛋白表達升高；相反，OPG蛋白表達降低。因此本研究認為，F(xiàn)AC是通過RANK/RANKL/OPG 信號軸途徑誘導MG-63 骨肉瘤細胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，F(xiàn)AC 具有抑制MG-63 骨肉瘤細胞生長，并誘導其凋亡的作用，其作用機理可能是通過下調OPG 的表達，使RANK、RANKL 和凋亡因子Caspase-3表達升高，誘導MG-63 骨肉瘤細胞發(fā)生凋亡。