基于天冬組培技術條件優化對植物組織培養課程的實踐教學探究

貴州大學 劉淼

20 世紀初，以植物細胞全能性為理論基礎，植物組織培養技術開始蓬勃發展。自應用以來，該技術創造了許多世界矚目的成就[1]，對挽救瀕危植物、植株脫毒、快速繁殖、培育新品種、種苗擴大生產等產生了重要的價值。因此，當前全國眾多高校生物學相關專業均開設有植物組織培養理論和實驗操作課程[2-4]。

天冬是我國傳統中藥，最早見于《神農本草經》，為藥典收載物種，具有養陰潤燥、清肺生津的作用，近代醫學研究表明其還有抑菌消炎、抗腫瘤、抗癌細胞等功效[5-6]，在食品和觀賞方面也具有極高價值[7-8]，市場需求大，但目前實際生產中種苗生產依舊存在一定困難，難以滿足日益擴大的市場需求。按照“十四五”期間規劃要求，強調科研成果要向生產力轉化，形成產教、產研、產學融合模式[9]。因此，通過組織培養技術的實踐操作，讓學生基于植物組培技術的基本原理，參與“天冬組培的適宜條件”的探究，解釋并歸納不同培養條件對組培結果的影響，讓學生在實踐課堂上體會到植物的生命活動，同時引導學生反思操作不足之處并建立更優實驗設計。

本文以天冬組培條件篩選為例，結合文獻匯總、方案設計、數據分析、問題討論、教學反饋等課程教學思路，使學生建立對植物組織培養的基本概念，加深學習該門課程重要性的認識。通過總結教學過程中存在的問題與不足，探究該課程的改革與創新模式，最終達到培養學生自主思考及科研精神，增強學生對生命科學領域興趣，強化學生動手實踐能力。該研究結果為植物組織培養實驗教學改革提供思路的同時，也為培養學生科研能力奠定基礎。

一、課程教學背景

植物的組織培養又叫離體培養，指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細胞，原生質體等，在無菌條件下接種在含有各種營養物質及植物激素的培養基上進行培養以獲得再生的完整植株或生產具有經濟價值的其他產品的技術[10]。目前該項技術理論基礎已較全面，且現有植物組培技術體系成熟，應用廣泛。但中藥材天冬通過組培實現種苗大規模生產還沒有顯著成果，未能投入生產實踐，限制了天冬種植產業發展。結合現實產業發展需要，在現有組培技術成果支持下創新開發天冬組培體系，通過學習理論知識，實踐操作方法，為人才培養和產業應用提供支持和保證。

二、研究內容

（一）教學內容

以天冬為研究對象，教師在理論課時對實驗基本原理、操作要領和注意事項加以講解，由學生完成配置培養基，實踐無菌技術操作，植物離體培養中的形態觀察等實驗步驟。探討不同部位帶芽莖段為外植體、不同消毒試劑及濃度、不同消毒時間對天冬叢生芽誘導的影響。

（二）實施方案

1、學生實驗的安排與設計。教師向學生講解植物組織培養發展歷程、組培技術原理、無菌操作技術要點和注意事項，讓學生為實踐操作做好準備。參與實驗項目的學生人數約30人。隨機平均分為5個組，每組6人，一名組長，統籌規劃小組總體實驗任務與安排。一是學生收集文獻資料，查閱并歸納總結，撰寫綜述。二是基于實驗需求和研究思路，設計實驗方案，由指導老師對其方案進行可行性分析并提出建議后，開展實驗。三是所需研究平臺、儀器設備及試劑耗材等均由研究院為學生提供。四是根據研究結果，指導學生完成總結和討論分析，撰寫實驗報告。

2、儀器與試劑。天冬外植體采集于貴州大學試驗基地，根據設計的實驗安排進行外植體處理與接種操作。

千分之一電子天平（C2002，杭州萬特衡器有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-100SⅡ，上海博迅實業有限公司）；超凈工作臺（SW-CJ-2D，上海蘇凈實業有限公司）；MS 培養基（青島高科技工業園海博生物技術有限公司）；瓊脂粉（北京索萊寶科技有限公司）；NAA（北京索萊寶科技有限公司）；6-BA（北京索萊寶科技有限公司）；次氯酸鈉（天津富宇精細化工有限公司）；氯化汞（升汞，Sigma-Aldric）；75%酒精；所用試劑均為分析純。

3、方法與結果。第一，誘導培養基配制：準確稱取4.74gMS 基礎培養基和30g 蔗糖溶于1L 蒸餾水中，添加0.1mg ·L-1NAA 和1.0mg ·L-16-BA 充分攪拌后調節pH 至5.8-6.0，轉移至組培瓶中高壓蒸汽滅菌。第二，外植體部位選擇：選取1年生天冬新抽芯枝條的不同部位帶芽莖段，置于流水下沖洗2h 除去表面灰塵；常規消毒后切至2cm 左右長度，接種于誘導培養基，統計誘導率及污染率。第三，消毒試劑配置及時間確定：分別精密稱量升汞0.25g、0.5g，溶解后轉移至250mL容量瓶中用蒸餾水定容，配置成體積分數為0.1%、0.2%的升汞溶液，同樣的方法配置1%、2%的次氯酸鈉溶液，用于外植體消毒。兩種消毒試劑設置不同的消毒時間，升汞溶液消毒時間梯度為4min、6min、8min；次氯酸鈉溶液為：6min、8min、10min。第四，操作步驟：將選取的不同部位帶芽莖段外植體流水沖洗4～6h后轉移至超凈工作臺中，切至2cm 左右的近端按照消毒設計方案消毒后，搭配75%酒精消毒5min，無菌水沖洗3～4 次，濾紙吸干多余水分，接種于誘導培養基中，21d后觀察實驗結果，統計不同外植體的誘導率與不同消毒試劑、濃度、時間的污染率。第五，實驗結果統計：外植體的選擇對于構建天冬組織培養快速繁殖體系是關鍵步驟，試驗結果表明，中段帶芽莖段誘導不定芽效果最佳，其誘導率達到了73.33%，誘導倍數為2.2倍，其次為下段帶芽莖段誘導率為37.78%，誘導倍數為1.23 倍，而頂端帶芽莖段效果較差誘導率只有13.11%，誘導倍數只有0.4倍，頂端誘導效果不明顯主要原因為頂端芽較為嫩綠，容易受環境的影響導致枯萎死亡不易誘導出不定芽。而中段芽段，老嫩適中，不容易受環境的影響，更容易具備分化出芽的能力。老段芽段雖然不易受環境的影響，但由于細胞的老化，減緩了分化成芽的概率。

本研究利用不同消毒劑及不同濃度和消毒時間進行試驗，結果表明，當次氯酸濃度達到2%時，消毒時間為10min時可大大降低污染率，升汞濃度達到0.2%時，消毒時間達到8min時也能有效降低污染（見圖1）。

圖1 不同消毒劑消毒效果

（三）實驗總結與討論

完成實驗后，各個小組針對結果進行分析，結合討論和總結，撰寫實驗報告。指導老師基于學生的操作過程和實驗結果，對該實驗的注意事項、重難點和下一步的研究計劃進行具體分析。

三、教學效果反饋

通過前期課堂理論知識學習，學生對實驗原理進行了解，同時查閱資料參與實驗方案設計、撰寫研究綜述、實踐操作培訓、數據處理分析等，培養了學生主動學習和探究能力，提高了無菌操作技能以及科研思維。第一，通過實驗，使學生清楚地知道植物組培的基本操作過程，也進行了無菌實踐操作，掌握該項技術核心操作要求；第二，通過實驗使學生了解植物組培外植體存活率和污染率與取材部位、消毒劑濃度和消毒時間有重要關系；第三，通過觀察天冬組培實驗結果，學生明白了組培實驗中條件的改變對最終結果的影響，將理論知識可視化，使整個過程更加生動形象；第四，以存活率和污染率為判定指標，對莖段為外植體的組培條件進行篩選，這個過程使學生明白材料差異和操作不同對最終結果的影響；第五，該項目為其他設計性實驗課程奠定了良好的基礎，進一步開拓了學生的自主創新思維。

四、實驗教學反思

（一）存在問題

1、學習被動。大多數高校開展實驗課程都是老師安排，學生跟著老師操作完成，最后撰寫一份實驗報告。學生對各因素具體影響效果不甚了解，整個過程很多都是機械地重復驗證性試驗，學生創新性思維得不到有效發揮，理論知識難以深化。

2、開展植物組織培養課程所選取的實驗材料單一。通常每種植物都具有其獨有特性和特點，而這門課程在生產實踐上應用的對象卻極為廣泛，難以達到普適性。

3、植物組織培養課程相對學時較短。理論學習課時占比大于實踐操作，學生真正動手的機會較少。

（二）解決措施

1、培養學生創新思維和自主學習能力。創新思維模式和良好的自主學習能力，是當代大學生需具備的重要能力，在本次實驗課程的教學過程中，通過特定的研究目標，讓學生自主查閱文獻、視頻資料，了解國內外研究進展，挖掘問題，設計技術路線，提出實驗方案，明確實驗內容，從而達到培養學生創新思維和自主學習能力的目的[11]。

2、材料多元化，面向實際應用。在課程開展時應當準備多種材料，讓學生有多項選擇，同時實驗課程要面向生產，結合當前社會生產實際需要，積極開拓領域。將“產學研”落實到課堂，培養學生為生產服務的意識[12]。

3、理論與實踐結合開展。在課程教學過程中，應該讓學生盡可能參與實驗，教師需結合實驗平臺對實驗進行可行性分析判斷，最大程度地滿足理論與實踐相結合的需求，如在實驗開展過程中引入理論知識，結合實際情況進行現場教學，讓學生對知識的理解更加深入。

五、總結

植物組織培養課程是一門應用性很強的課程，無論是珍稀植物的保存、繁殖，還是園藝花卉的生產或者生產種用的育苗和脫毒復壯等等，都需要用到組織培養技術的知識。但在很多高校組培課程開展上還停留在表面形式，這限制了學生的開創思維、學習興趣和自主學習能力，從根本上限制了組培相關技術與產業發展。高校在開展實驗課程時需要加強教學改革，實現教、研結合，激發學生自主學習興趣，主動提出研究內容、設計實驗方案并開展實驗，使其主觀能動性得到充分發揮，使其具有創新思維、開拓精神和實踐動手能力。最終推動學科發展，讓學生具備新時代人才所要求的職業素養，成為未來產業發展的支柱。