青錢柳提取物體內外抗氧化活性評價方法研究進展*

崔素華 梁 楓 丁伯平 秦亞東 汪榮斌 張 瑞

1 安徽中醫藥高等專科學校基礎教學部藥理教研室,安徽省蕪湖市 241000; 2 皖南醫學院藥學系藥理教研室

青錢柳又名搖錢樹、青錢李,是我國南方的藥食同源植物,系胡桃科青錢柳屬,為國家二級保護樹種。隨著對青錢柳作用了解的深入,青錢柳被國家列為功能性食品原料,需求量大大增加。青錢柳的天然活性成分有多糖、三萜、黃酮和酚酸等[1]。我國自1970年對青錢柳研究以來發現青錢柳有抗氧化、降血糖、降血脂、調節免疫力、抗衰老、抑菌等作用[2-5]。

近年來,大量研究表明,合理使用抗氧化劑可以預防疾病、延緩疾病的發展進程。人工合成的抗氧化劑雖然抗氧化活性強,但對機體有潛在危害,于是如何從天然產物中提取安全有效的抗氧化物質成為抗氧化研究的主要趨勢,準確評價天然植物的抗氧化活性是目前研究的熱點。本文概括了目前青錢柳研究中常用的抗氧化研究方法,有利于青錢柳的進一步開發利用。目前有關抗氧化活性的檢測大多采取的是體外抗氧化活性評價法、細胞模型抗氧化活性評價法與體內抗氧化活性評價法。

1 體外抗氧化活性評價方法

體外抗氧化評價方法實驗操作簡單快速并且不需要動物實驗,因此一般首選體外評價法對物質的抗氧化活性進行初篩。目前常用于對青錢柳進行抗氧化活性檢測的機制主要有以下幾種:(1)檢測樣品清除自由基的能力;(2)檢測樣品的還原能力;(3)檢測樣品對脂類物質的氧化抑制能力。

1.1 清除自由基型評價方法 自由基由于含有未配對電子,所以極不穩定,其氧化反應能力很強,能使機體內的大分子物質過氧化,從而導致不可逆性損傷,自由基過量是許多疾病產生的誘因。清除自由基是抗氧化劑發揮抗氧化作用的主要機制,因此評價青錢柳的自由基清除能力可以作為評價其抗氧化活性的重要指標。

1.1.1 清除DPPH自由基評價方法:DPPH(二苯代苦味酰基自由基)清除方法由Bios[6]于1958年首先提出, 其自由基非常穩定,在乙醇等溶液中顯紫色,在517nm處吸光值很強,DPPH清除方法因為操作簡單快捷,被廣泛應用于青錢柳提取物的抗氧化能力測定。

鄒榮燦等[7]以甲醇定容DPPH溶液,對不同產地青錢柳多糖進行DPPH清除能力研究發現,在0.01～2.0mg/ml濃度范圍內,青錢柳多糖對DPPH的清除能力隨多糖濃度的上升而增大,呈一定量效關系,各產地青錢柳多糖對DPPH清除能力的差異不明顯,青錢柳的抗氧化能力與其多糖濃度呈劑量關系。岳喜良等[8]以甲醇定容DPPH溶液,對青錢柳樣品進行DPPH清除能力研究發現,施氮量顯著影響了青錢柳葉中DPPH的IC50(DPPH為50%時的樣品濃度),DPPH的IC50與黃酮類化合物呈顯著負相關,低氮處理的青錢柳葉抗氧化能力明顯高于其他實驗組。

DPPH方法簡單快捷且重現性好,是評價青錢柳抗氧化活性應用頻率最高的分析方法之一,但是缺點是清除反應僅在甲醇、乙醇等有機溶劑中發生, 不能在水溶液中應用,針對這個缺點部分學者對此進行了改進,使其能在水溶液中進行測定。黃四新等[9]通過改進的方法用水將青錢柳化合物稀釋后配制成不同濃度的DPPH溶液進行測定,發現化合物濃度與DPPH清除能力呈明顯量效關系,且都能較快達到最大清除能力,部分化合物對DPPH的清除能力強于維生素C。

1.1.2 清除ABTS自由基評價方法:ABTS[2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽]自由基清除方法由Marklund[10]于1979年首先提出。ABTS是一種化學顯色劑,在734nm或414nm處測定反應溶液吸光度即可測定樣品的抗氧化能力。

TEAC[2,2-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)]自由基方法是Miller[11]于1993年開發的基于ABTS清除自由基的方法,其所用的自由基溶液是預先反應好的溶液,與傳統的ABTS方法相比可以降低植物提取物等抗氧化物質中其他化合物的影響。

鄭曉杰等[12]對青錢柳提取物進行ABTS清除能力測定,發現青錢柳提取物可有效清除ABTS自由基,且存在采收期和產地變異性。郭彤彤等[13]對青錢柳黃酮進行TEAC法檢測發現,樣品的ABTS自由基清除活性呈濃度依賴性變化,證實青錢柳黃酮在食用大豆油中的應用能減緩大豆油的氧化,延長儲存期限,并且可以預防人體疾病,避免合成抗氧化劑引起的食品安全問題。

ABTS法因為快速簡便被普遍用于常規抗氧化劑清除自由基能力的評價,水溶性化合物和脂溶性化合物都可以測定。不過ABTS法本質上是用TEAC值來表征被測物質清除ABTS+·這種自由基的能力, 并不是直接反映被測物質的活力,所以想全面的評估一種物質的抗氧化能力需要結合其他方法進行全方位的測定。

1.1.3 清除超氧陰離子自由基評價方法:超氧陰離子自由基(O2·-)是自由基引起機體中毒的主要原因,其作為鏈式反應的引發劑可以通過反應生成其他自由基,導致多糖解聚、核酸鏈斷裂以及不飽和脂肪酸過氧化,引起膜損傷、線粒體氧化磷酸化而導致機體疾病。因此,檢測青錢柳對O2·-的清除能力可以用來評價其抗氧化活性。超氧陰離子O2·-評價方法是通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)還原吩嗪硫酸甲酯-(PMS)生成O2·-,然后和氯化硝基四氮唑藍(NBT)反應生成在560nm有強吸收峰的藍色產物,當抗氧化物質加入PMS-NADH-NBT體系后,通過吸光度測定可以計算出抗氧化物質的清除自由基能力。

胡世一等[14]以維生素C作陽性對照,在536nm處檢測青錢柳內生真菌發酵產物清除O2-·的能力,發現18株菌株清除O2-·能力普遍較弱,清除率均<50%。黃新月等[15]對青錢柳多糖的超氧自由基清除能力進行檢測,發現其清除率隨濃度的增加而增加,呈劑量依賴關系。同時多糖的羧甲基化取代度升高后清除率降低,考慮可能與羧甲基化修飾以后青錢柳多糖溶解性降低有關。

1.1.4 清除羥基自由基評價方法:羥基自由基(OH·)是毒性最大的自由基,氧化能力很強,帶有一個不成對電子,可以引起電子轉移、奪取氧原子和羥基化等反應,與活細胞中的分子發生反應導致組織脂質過氧化、核酸斷裂、蛋白質解聚與聚合、多糖解聚而造成損害。羥自由基清除法也是評價青錢柳體外抗氧化活性比較常用的方法。

劉賢賢等[16]對65%甲醇的青錢柳葉浸膏進行羥自由基清除能力測定,發現在相同實驗條件下,IC50越小,對羥自由基的清除能力越大,抗氧化效果越好。夏和元等[17]以不同時間采集的青錢柳葉為研究對象,檢測其對OH·的清除能力,發現樣品對羥基自由基有較好的清除能力但存在明顯差異,其中7月份綠色葉陰干和殺青樣品效果最好。

1.2 還原金屬離子評價方法 物質的還原能力與其抗氧化活性之間有著明顯的相關性,目前最常用的是還原金屬離子評價方法是還原鐵離子法(FRAP)。FRAP最早由Benzie等[18]提出,主要用于血漿中抗氧化成分的評價,后來廣泛用于植物抗氧化活性檢測。該方法的原理是在較低pH環境下,Fe3+-三吡啶三吖嗪可被樣品還原為二價鐵形式,呈現出藍色,吸光度593nm時光吸收值最高,根據其吸光度值的大小評價抗氧化能力,吸光度值與抗氧化能力成正比。

陳培等[19]對不同基因型青錢柳進行四種不同的光質處理后測定其FRAP,發現藍光和綠光更有利于提高青錢柳葉中抗氧化活性,藍光處理和金鐘山基因型的青錢柳葉抗氧化能力方面表現更佳。實驗結果表明在青錢柳培育過程中,可通過改變光照、選擇基因型來提高青錢柳葉的抗氧化活性。陳瑋玲等[20]對不同青錢柳葉提取物進行FRAP測定,發現樣品還原能力與DPPH自由基清除能力相似,四種不同溶劑提取物中70%乙醇提取物還原能力最強,總酚、總黃酮含量與還原能力呈正相關。

FRAP方法操作簡單快捷、重現性好,但也有學者認為其生物相關性較差,不能作為抗氧化能力檢測的最佳選擇。

1.3 抑制脂質過氧化評價方法 脂質中不飽和脂肪酸通過自動氧化生成不穩定狀態的氫過氧化物,然后繼續分解生成短碳鏈的小分子化合物如醛、酮等。硫代巴比妥酸法常用于檢測青錢柳的脂質過氧化,其原理是體內高不飽和的脂肪酸經過氧化生成過氧化脂質(LPO),最后生成丙二醛(MDA)。

吳菲菲等[21]對不同濃度的青錢柳多糖溶液進行脂質過氧化(LPO)抑制能力檢測,發現青錢柳多糖對卵黃脂蛋白過氧化的抑制作用與濃度呈正相關。當濃度為1.6mg/ml時,青錢柳粗多糖和精制多糖對卵黃脂蛋白過氧化的抑制作用最強,在0.05～1.6mg/ml范圍內,青錢柳粗多糖對LPO的抑制效果優于其精制多糖。段小群等[22]對青錢柳多糖進行抗脂質過氧化研究發現,青錢柳多糖可減輕小鼠肝組織自發性及自由基誘導劑引起的肝脂質過氧化水平,闡明青錢柳多糖有明顯的抗脂質過氧化作用,并具有一定的量效關系。

脂質體系抗氧化檢測的缺點主要是實驗耗時長且操作相對復雜, 實驗結果也容易受到多種因素影響。

2 體內抗氧化活性評價方法

體外抗氧化活性評價方法的優點是操作簡單迅速、重現性好,但體外評價體系與生物體內實際環境相差較大,某些在體外評價法里表現出高抗氧化活性的物質在生物體內可能活性較差,所以需要在體外評價后再進行體內評價從而進一步證實抗氧化劑的活性。青錢柳體內抗氧化活性評價可以通過在相應實驗周期內檢測動物體內某些酶活性或代謝產物含量來進行抗氧化能力判斷,SOD、MDA、GSH-Px等常被用作重要的抗氧化指標, 它們的協同作用可以維持機體自由基的動態平衡, 同時阻止脂質過氧化和此過程中產生的中間產物對機體造成損害。

2.1 超氧化物歧化酶(SOD)法 SOD是一種抗氧化金屬酶,可以催化超氧陰離子自由基歧化生成過氧化氫和氧,可以保持生物體自由基產生和過氧化物清除能力均衡,從而起到保護細胞的作用。

2.2 丙二醛(MDA)法 MDA是在脂質過氧化反應鏈終止階段產生,可以引起細胞腫脹壞死、細胞膜結構破壞。通過對MDA進行含量測定,可以分析機體細胞受到自由基攻擊時組織的損傷程度。

2.3 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)法 GSH-PX是一種過氧化物分解酶,催化還原型谷胱甘肽變為氧化型谷胱甘肽,可以使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物,同時還可以促進H2O2的分解,減少氧自由基損傷細胞。

趙靜等[23]研究發現青錢柳能明顯增高肝臟SOD和GSH-Px的活性,降低肝臟MDA的含量,通過清除機體內脂質過氧化產物,間接發揮抗氧化作用。盧振華[24]研究發現青錢柳可以顯著增高SOD的活性, 降低機體內MDA含量,保護機體免受自由基傷害。陳丹等[25]研究發現富硒青錢柳—黃精復方可有效提高2型糖尿病大鼠血清中SOD、GSH-Px的活性,降低血清中MDA的含量,降低氧化應激程度,改善糖尿病動物機體抗氧化能力。

3 細胞模型抗氧化活性評價方法

動物實驗結果準確,可以真實反映青錢柳在體內的抗氧化程度,但費用較高、實驗周期也較長,所以也可以通過細胞模型抗氧化活性評價方法進行評價。

賀海波等[26]在對青錢柳不同溶劑提取物進行研究時發現,其對模型大鼠胰島細胞瘤細胞(INS-1)細胞的保護作用與其增強內源性抗氧化系統功能密切相關。羅丹等[27]發現富硒青錢柳—蛹蟲草復方能降低NIT-1細胞內ROS水平,發揮抗氧化作用。王胤康等[28]研究了青錢柳多糖和黃酮對胰島素抵抗的人源肝癌細胞的影響,發現它們能夠逆轉胰島素抵抗,增加肝癌細胞葡萄糖攝取量,降低α-葡萄糖苷酶活性。

4 展望

青錢柳是一種具有多種功能的生物抗氧化劑,綜合對其進行抗氧化成分研究的過程發現,每種抗氧化活性評價方法都有一定的局限性和缺點,如果僅通過一種方法來進行評價是不合理。因此,應該建立一套多方案評價體系來評價青錢柳的抗氧化能力,使實驗結果更有科學利用價值,更好地為青錢柳的開放利用提供參考依據。