啟動子上的增強子和CpG島在轉基因沉默和位置效應中的作用

肖 捷，紀 華，王 宵，王 靜，劉凌云，李美荃，王 斌

(1.大理大學藥學院,云南 大理 671000;2.云南省第一人民醫院腫瘤科,云南 昆明 650034;3.昆明學院云南教育廳新型畜禽疫苗及產業關鍵技術工程研究中心,云南 昆明 650214)

重組蛋白藥物是利用基因工程技術表達的產物,用于彌補體內某些功能蛋白的缺失[1],在生物醫藥領域被廣泛應用。但是,目前在哺乳動物細胞中重組蛋白藥物的高效和穩定表達仍是生產上的主要難題。外源基因在哺乳動物細胞中高效和穩定表達的主要障礙與轉基因沉默效應和位置效應等表觀遺傳機制有關。轉基因沉默是宿主細胞中轉入的外源基因受到細胞的內在機制的抑制而不表達,這是生物體在基因調控上的一種自我保護機制,也是基因工程產品生物實用化和商品化的巨大障礙[2-3]。轉基因沉默可發生在轉錄水平、轉錄后水平和染色質DNA水平3種不同層次上[4-5]。位置效應是指當轉基因插入轉錄不活躍區域或異染色質區域,導致轉基因處于低水平的轉錄或不能轉錄[6-7]。啟動子上的調控元件能影響轉基因沉默和位置效應[8],如增強子能消除DNA甲基化[9-10],CpG島調節元件對DNA甲基化具有抵抗能力等[11]。但是,啟動子上的調節元件如何影響轉基因沉默效應和位置效應尚不完全清楚。多能干基因八聚體結合轉錄因子4(octamer binding transcription factor 4,OCT4)、性別決定區Y框蛋白2(sex determining region Y box protein 2,SOX2)和NANOG是典型的受表觀遺傳調控的細胞命運決定基因的關鍵因子,其中OCT4基因啟動子主要包含近端增強子和近端啟動子,SOX2基因啟動子包含CpG島,而NANOG基因啟動子不含近端增強子和CpG島[12-13]。同時含CpG島和增強子的巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)基因啟動子是真核表達載體中常用的高表達啟動子[14],能夠在多種不同類型的細胞中高效表達外源基因。本研究觀察NANOG、SOX2、OCT4、CMV基因啟動子介導的載體穩定轉染到中國倉鼠卵巢細胞株CHO-K1細胞和人胚胎腎細胞(human embryonic kidney 293,HEK293)中的表達差異,以及各啟動子介導的載體轉染后在不同時間段所受的轉基因沉默效應和不同單克隆中受位置效應的影響,探討啟動子上增強子和CpG島調節元件在轉基因沉默和位置效應中的作用,以期為構建高效穩定表達的載體提供理論依據,為解決重組蛋白藥物在生產過程中的低產量、不穩定等問題提供方向。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑與儀器

中國倉鼠卵巢細胞株CHO-K1和HEK293細胞株(冷凍管干冰保存運輸)購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。含增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)載體pE-C1購自上海生工生物工程股份有限公司,pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog 載體為云南教育廳新型畜禽疫苗及產業關鍵技術工程研究中心構建,卡那霉素購自大連美侖生物技術有限公司,胰蛋白酶細胞消化液購自上海碧云天生物技術有限公司,胎牛血清購自以色列Biological Industries公司,大提質粒試劑盒購自美國Omega 公司,總RNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,AseⅠ酶和AgeⅠ酶購自TaKaRa寶生物技術(大連)有限公司,引物由昆明碩擎生物科技有限公司合成;聚合酶鏈式反應儀購自美國ABI公司,電穿孔系統、電擊杯型號640購自美國BTX公司,熒光倒置顯微鏡購自德國Leica公司,SpectraMax M2酶標儀購自美國Molecular Devices公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog載體構建

取pE-C1載體,用AseⅠ酶和AgeⅠ酶對pE-C1載體行雙酶切,去除mCMV基因啟動子片段,用人源OCT4、SOX2、NANOG基因啟動子連接在mCMV基因啟動子去除片段位置進行載體構建,從而獲得pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog 3種載體。

1.2.2 細胞培養

將CHO-K1細胞接種于含體積分數10%胎牛血清和體積分數1%雙抗的RPMI 1640培養基中,將HEK293細胞接種于含體積分數10%小牛血清和體積分數1%雙抗的達爾伯克改良伊格爾培養基,置于37 ℃、含體積分數5% CO2的細胞培養箱中培養;待細胞融合達80%～90%時傳代,按所需濃度接種至培養瓶中或細胞培養板上,用于后續實驗。

1.2.3 細胞轉染及G418篩選單克隆細胞株

將CHO-K1、HEK293細胞轉移到75 cm2細胞培養瓶中,細胞融合達50%～70%時,用胰蛋白酶消化細胞,加入1 mL RPMI 1640培養基獲得細胞混懸液;分別取400 μL細胞混懸液(細胞數約為 2×106)和pE-C1、pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog 載體質粒(各20 μg)加入到電擊杯中混勻,進行電擊轉化;將電擊杯放入電擊槽中,280 V、20 ms脈沖電擊1次,電擊后將電擊杯于冰上靜置5 min;將CHO-K1和HEK293細胞分別吸入含有0.8 mL CHO-K1細胞培養基和HEK293細胞培養基的12孔板中,置于37 ℃、含體積分數5% CO2的恒溫培養箱中培養24 h,待細胞融合度達50%～70%時,加入700～800 mg·L-1G418 15 μL;48 h后觀察細胞,當有大量細胞死亡時,換成篩選培養基培養,將G418濃度減半,持續G418加壓篩選,直至細胞克隆生成;10～14 d 左右細胞克隆形成,長出肉眼可見的單克隆細胞株后,使用軟瓊脂法篩選細胞單克隆;將單個細胞株挑至96孔板內,移液槍吹打細胞形成細胞懸液,置于37 ℃、含體積分數5%CO2培養箱中培養,細胞貼壁生長后,在熒光顯微鏡下篩選單克隆細胞株。

1.2.4 熒光強度分析EGFP蛋白表達

使用熒光顯微鏡對構建載體穩定轉染第20天的CHO-K1細胞和HEK293細胞以及構建載體穩定轉染第30天的CHO-K1細胞進行熒光拍照,參數:10倍焦距;70%綠光、藍光和白光強度,每個樣品選取3個不同拍攝點進行拍照,并應用Image J 軟件中Mean算法對熒光圖片進行熒光強度分析,以熒光強度值代表EGFP蛋白表達。

1.2.5 克隆表達差異分析

應用Image J 軟件中Mininum、Maxentropy、Mean 3種算法分別計算pE-C1、pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog 4個載體穩定轉染后形成的多個單細胞克隆混合生長樣品在同一個樣本中最大熒光強度的細胞、大于平均熒光強度的所有細胞和最小熒光強度的所有細胞的平均熒光強度值,以此表示該樣品中表達載體整合在不同位置導致的表達差異,反映其克服位置效應后的穩定表達程度[13]。

1.2.6 單克隆篩選和熒光強度分析EGFP蛋白表達

采用有限稀釋法從G418篩選后獲得的穩定轉染多個單克隆混合CHO-K1細胞中分別篩選pE-C1、pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog質粒穩定轉染的單克隆細胞,每個質粒載體隨機篩選3個單克隆細胞,應用Image J軟件進行平均熒光強度分析,根據平均熒光強度觀察載體整合位置不同的單克隆細胞中EGFP熒光強度變化。

1.2.7 酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法檢測CMV、OCT4、SOX2、NANOG基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP蛋白

將篩選出的CHO-K1單克隆細胞株在T25培養瓶中擴大培養,待細胞融合達90%時,加入適量NP-40裂解液于冰上充分裂解,使用移液器將裂解物移至1.5 mL離心管中,4 ℃下14 000×g離心10 min,取上清液,置于新的1.5 mL離心管中,得到待測蛋白樣品;對標準品進行稀釋,終質量濃度分別為10、8、6、4、2 μg·L-1,各孔分別加50 μL;將pE-C1、pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog質粒穩定轉染的4種單克隆細胞待測蛋白樣品進行11稀釋,將稀釋后的標準品和待測樣品加入反應孔中,立即加入50 μL小鼠EGFP單抗,蓋上膜板,輕輕振蕩搖勻,37 ℃ 孵育1 h;洗滌后在各反應孔中加入0.1 mL新鮮稀釋的親和鏈霉素-辣根過氧化物酶,37 ℃孵育0.5～1.0 h,洗滌3次后,加底物液四甲基聯苯胺顯色,應用酶標儀于波長450 nm處檢測各孔吸光度值,繪制樣品標準曲線,根據標準曲線計算EGFP蛋白表達水平。實驗重復3次,取均值。

1.2.8 實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測CMV、OCT4、SOX2、NANOG基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP mRNA

取篩選得到的pE-C1、pE-Oct4、pE-Sox2、pE-Nanog 質粒穩定轉染的CHO-K1單克隆細胞,用TRIzol試劑提取細胞總RNA,用反轉錄試劑盒將1.0 μg RNA反轉錄為cDNA。PCR反應體系:cDNA 2.0 μL,上下游引物各0.4 μL,Eastep?qPCR Master Mix 2×10.0 μL,Rox 0.4 μL,無酶水 6.8 μL。 引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。EGFP上游引物序列為5′-GTGCAGTGCTTCAGCCGCTAC-3′,下游引物序列為5′-GTGCAGT GCTTCAGCCGCTAC-3′;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上游引物序列為5′-GTGCAGTGCTTCAGCCGCTAC-3′,下游引物序列為5′-GTGCAGTGCTTCAGCCGCTAC-3′。以內參GAPDH的循環數作為對照,將配制好的樣品和內參置于熒光定量 PCR儀(EppendorfQX200)上進行PCR擴增反應,采用2-△△Ct法計算CHO-K1細胞中EGFP mRNA的相對表達量。實驗重復3次,取均值。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 不同時段內不同啟動子對轉基因沉默效應的反應

pE-Sox2、pE-Oct4、pE-Nanog、pE-C1載體構建成功,其結構見圖1。

圖1 含SOX2、CMV、OCT4、NANOG基因啟動子表達載體的結構示意圖Fig.1 Structural diagram of expression vector containing SOX2,CMV,OCT4 and NANOG gene promoter

SOX2基因啟動子在CHO-K1細胞和HEK293細胞中介導表達的EGFP平均熒光強度分別為0.200±0.081、0.150±0.060,SOX2基因啟動子在CHO-K1細胞和HEK293細胞中介導表達的EGFP平均熒光強度比較差異無統計學意義(t=0.770,P>0.05)。OCT4基因啟動子在CHO-K1細胞和HEK293細胞中介導表達的EGFP平均熒光強度分別為0.250±0.041、0.061±0.019;OCT4基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP平均熒光強度顯著高于HEK293細胞,差異有統計學意義(t=7.000,P<0.05)。CMV基因啟動子在CHO-K1細胞和HEK293細胞中介導表達的EGFP平均熒光強度分別為 0.330±0.020、0.180±0.013;CMV基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP平均熒光強度顯著高于HEK293細胞,差異有統計學意義(t=11.100,P<0.05)。NANOG基因啟動子在CHO-K1細胞和HEK293細胞中介導表達的EGFP平均熒光強度分別為 0.240±0.029、0.150±0.020;NANOG基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP平均熒光強度顯著高于HEK293細胞,差異有統計學意義(t=4.900,P<0.05)。 結果見圖2。

圖2 攜帶不同啟動子的載體在CHO-K1細胞和HEK293細胞中介導EGFP基因的表達Fig.2 Expression of EGFP in CHO-K1 cells and HEK293 mediated by vectors carrying different promoters

ELISA結果顯示,轉染第20、30天,SOX2基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP蛋白水平分別為(1.77±0.18)、(1.81±0.04)μg·L-1;SOX2基因啟動子轉染第20、30天在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP蛋白水平比較差異無統計學意義(t=0.330,P>0.05)。轉染第20、30天,CMV基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP蛋白水平分別為(2.19±0.17)、(1.74±0.07)μg·L-1;CMV基因啟動子轉染第20天在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP蛋白水平顯著低于轉染第30天,差異有統計學意義(t=3.770,P<0.05);轉染第20、30天,OCT4基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP蛋白水平分別為(2.11±0.16)、(1.84±0.10)μg·L-1;OCT4基因啟動子轉染第20、30天在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP蛋白水平比較差異無統計學意義(t=2.500,P>0.05)。轉染第20、30天,NANOG基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP蛋白水平分別為(2.02±0.14)、(2.02±0.09)μg·L-1;NANOG基因啟動子轉染第20、30天在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP蛋白水平比較差異無統計學意義(t=0.014,P>0.05)。熒光強度分析顯示,轉染第20、30天,SOX2基因啟動子在CHO-K1 細胞介導表達的EGFP平均熒光強度值分別為0.140±0.020、0.140±0.009,CMV基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP平均熒光強度值分別為0.220±0.032、0.240±0.015,NANOG基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP平均熒光強度值分別為0.220±0.005、0.220±0.063;轉染第20天與轉染第30天,SOX2、CMV、NANOG基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP平均熒光強度值比較差異均無統計學意義(t=0.130、0.830、0.210,P>0.05)。轉染第20、30天,OCT4基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP平均熒光強度值分別為0.250±0.042、0.099±0.015;OCT4基因啟動子轉染第30天在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP平均熒光強度值顯著低于轉染第20天,差異有統計學意義(t=5.750,P<0.05)。 結果見圖3。

2.2 不同啟動子介導翻譯階段轉基因沉默效應

SOX2、CMV、OCT4和NANOG基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP蛋白水平分別為(1.77±0.18)、(2.19±0.17)、(2.11±0.16)、(2.02±0.14)μg·L-1,SOX2、CMV、OCT4、NANOG基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP蛋白水平比較差異無統計學意義(F=4.070,P>0.05)。SOX2、CMV、OCT4、NANOG基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP mRNA相對表達量分別為0.013±0.007、0.400±0.120、1.190±0.410、1.670±0.510;CMV、OCT4、NANOG基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP mRNA相對表達量顯著高于SOX2基因啟動子,差異有統計學意義(t=5.440、5.000、5.740,P<0.05);CMV、OCT4基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP mRNA相對表達量顯著高于NANOG基因啟動子,差異有統計學意義(t=3.220、4.270,P<0.05);CMV基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP mRNA相對表達量高于OCT4基因啟動子,但差異無統計學意義(t=1.270,P>0.05)。

為研究SOX2、CMV、OCT4、NANOG基因啟動子在轉錄水平和轉錄后水平的差異,轉錄水平用EGFP mRNA相對表達量表示,轉錄后水平用EGFP蛋白水平來表示,以1.5為基準對轉錄水平和轉錄后水平進行相對定量分析,結果顯示,SOX2基因啟動子介導表達的EGFP在轉錄水平和轉錄后水平差異最大(t=16.900,P<0.05),NANOG基因啟動子介導表達的EGFP在轉錄水平和轉錄后水平差異次之(t=14.930,P<0.05),OCT4和CMV基因啟動子介導表達的EGFP在轉錄水平和轉錄后水平差異最小(t=2.060、0.430,P>0.05)。結果見表1。

2.3 不同細胞克隆顯示不同啟動子克服位置效應的能力

用Mininum、Maxentropy、Mean等3種算法計算OCT4基因啟動子在多克隆下介導表達的EGFP熒光強度值分別為0.170±0.049、0.082±0.066、0.210±0.085,三者比較差異無統計學意義(F=3.720,P>0.05);SOX2基因啟動子在多克隆下介導表達的EGFP熒光強度值分別為0.290±0.012、0.110±0.022、0.490±0.001,三者比較差異有統計學意義(F=516.400,P<0.05);CMV基因啟動子在多克隆下介導表達的EGFP熒光強度值分別為0.440±0.009、0.096±0.004、0.580±0.035,三者比較差異有統計學意義(F=428.500,P<0.05);NANOG基因啟動子在多克隆下介導表達的EGFP熒光強度值分別為 0.380±0.062、0.150±0.058、0.500±0.055,三者比較差異有統計學意義(F=28.120,P<0.05)。不同單克隆細胞中的差異分析顯示,OCT4基因啟動子介導表達的EGFP熒光強度值分別為0.085±0.009、0.083±0.020、0.075±0.013,標準誤差值為0.005;CMV基因啟動子介導表達的EGFP熒光強度值分別為0.093±0.004、0.099±0.017、0.100±0.009,標準誤差值為 0.004;NANOG基因啟動子介導表達的EGFP熒光強度值分別為0.210±0.016、0.160±0.012、0.092±0.010,標準誤差值為0.057;SOX2基因啟動子介導表達的EGFP熒光強度值為0.110±0.008、0.140±0.016、0.099±0.029,標準誤差值為0.019。4種載體在不同單克隆細胞中介導表達的EGFP熒光強度值的標準誤差相比,從高到低依次為NANOG基因啟動子在不同單克隆細胞中介導表達的EGFP熒光強度值標準誤差、SOX2基因啟動子在不同單克隆細胞中介導表達的EGFP熒光強度值標準誤差、OCT4基因啟動子在不同單克隆細胞中介導表達的EGFP熒光強度值標準誤差、CMV基因啟動子在不同單克隆細胞中介導表達的EGFP熒光強度值標準誤差,且OCT4基因啟動子與SOX2、CMV基因啟動子在單克隆細胞中介導表達的EGFP平均熒光強度比較差異有統計學意義(t=3.070、4.360,P<0.05)。結果見圖4。

圖4 穩定轉染4種質粒載體的單克隆細胞中EGFP熒光圖Fig.4 Fluorescence images of EGFP in the monoclonal cells stably transfected with four plasmid vectors

3 討論

啟動子上的CpG島是發生DNA甲基化的主要區域,甲基化的CpG島會通過干擾轉錄因子的結合使其所調控的基因表達受到抑制[15-17];同時啟動子上的CpG島大多不發生甲基化,這就使帶CpG島的啟動子具有克服轉基因沉默效應的結構基礎[18-20]。研究報道,帶增強子的啟動子在不同細胞中受轉基因沉默效應的影響差異最明顯[21-22],且OCT4基因啟動子上的增強子調控元件活性會受到細胞類型特異性DNA甲基化的影響[23]。本研究結果顯示,帶CpG島的SOX2基因啟動子介導的EGFP在CHO-K1細胞和HEK293細胞中表達量比較差異無統計學意義;這說明,啟動子上的CpG島有助于介導基因在不同細胞染色質環境中的穩定表達。而本研究結果同時顯示,OCT4、CMV和NANOG基因啟動子在CHO-K1細胞中介導表達的EGFP基因平均熒光強度顯著高于HEK293細胞,說明,OCT4、CMV和NANOG基因啟動子在CHO-K1細胞中表達的穩定性更高;因此,本研究選擇CHO-K1細胞為觀察細胞。

本研究通過對含增強子和CpG島調控的啟動子介導表達的標記基因EGFP在CHO-K1細胞中的表達分析,以其轉染不同時段表達量變化作為表達載體受轉基因沉默效應影響的衡量標準,結果表明,轉染第20、30天,帶CpG島的SOX2基因啟動子介導表達的EGFP蛋白水平比較差異無統計學意義,帶增強子和CpG島的CMV基因啟動子介導的EGFP蛋白水平有顯著差異;而帶增強子的OCT4基因啟動子介導的EGFP表達在轉錄水平差異極顯著,在翻譯水平差異也非常明顯;這說明,含CpG島的啟動子受轉基因沉默效應的影響小,而增強子單獨作用的啟動子介導的EGFP表達受轉基因沉默效應的影響較大。本研究結果顯示,CpG島和增強子共同作用在同一個啟動子上時,在EGFP翻譯表達水平上具有顯著差異,而在EGFP基因轉錄水平上差異不顯著;這說明,帶增強子和CpG島的CMV基因啟動子受轉基因沉默效應的影響介于帶CpG島的SOX2基因啟動子和帶增強子的OCT4基因啟動子之間;相比之下,不含CpG島和增強子的NANOG基因啟動子受轉基因沉默效應的影響與只帶CpG島的啟動子相當,提示增強子與CpG島共同作用時,存在抵消后者克服轉基因沉默效應的現象;因此,推測啟動子上的CpG島可能具有較強克服轉基因沉默效應的能力,而增強子可能會有利于轉基因沉默效應的發生。另外,本研究結果顯示,帶增強子的OCT4基因啟動子增強基因表達的同時會使其在不同細胞環境中表達量差異顯著,同時帶CpG島和增強子的CMV基因啟動子和不含CpG島和增強子2個調節元件的NANOG基因啟動子均有顯著差異;這也說明,增強子的存在可抵消CpG島克服轉基因沉默效應。綜上所述,啟動子上的CpG島具有克服轉基因沉默效應的能力。

本研究結果顯示,帶CpG島的SOX2基因啟動子介導的EGFP蛋白表達水平與EGFP mRNA相對表達量之間具有顯著差異,且在轉錄后水平的表達遠大于轉錄水平的表達,這可能是因為SOX2基因啟動子上的轉錄起始位點后300 bp附近的CpG島對轉錄后mRNA 5′端非翻譯區(5′untranslated region,5′UTR)區有顯著影響。研究報道,帶CpG島的啟動子在不同細胞中的穩定表達體現在轉錄后水平的克服轉基因沉默效應能力,而帶增強子的啟動子克服轉錄后水平轉基因沉默的能力弱[24-27]?；虮磉_的轉錄后水平調控是以mRNA為中心[28],真核細胞mRNA主要通過包含了保守的莖環結構的5′UTR參與轉錄后協同調控的生物路徑影響轉錄后水平[29]。CpG島的啟動子中的5′UTR可以啟動轉錄翻譯的過程,由此間接促進轉錄后水平表達,克服轉錄后水平的轉基因沉默效應[30]。另外,高CG的5′UTR區也可能會導致mRNA水平的RNA甲基化程度的增加[31]。一方面,增強子通過粘連蛋白復合物參與,再結合轉錄因子能夠在空間上形成的增強子-啟動子染色質環[32],增強子形成的染色質環可在一定程度上調控細胞特異性基因表達。另一方面,增強子具有參與蛋白質修飾、開放染色質結構等經典表觀遺傳特征,介導表觀改變與轉錄因子之間的相互作用,可實現精確和動態的基因調節表達[33-34]。用同一個載體在不同單克隆中的熒光強度標準差及多個克隆群體中的表達差異,作為反映該載體在同一細胞中不同整合位置表達能力差異的評判標準,以考察不同載體克服位置效應的能力[13]。本研究結果顯示,帶增強子的OCT4基因啟動子在不同單克隆細胞中介導的熒光強度值和同時帶增強子和CpG島的CMV基因啟動子在不同單克隆細胞中熒光強度比較差異無統計學意義,說明OCT4和CMV基因啟動子在CHO-K1細胞中均能較好地克服位置效應的影響;而帶CpG島調節元件的SOX2基因啟動子在不同單克隆細胞中介導的熒光強度值的標準誤差最大,克服位置效應的能力最弱;由此說明,CpG和增強子共同作用在同一啟動子上時,其克服位置效應的能力有所增強,這可能是帶增強子的啟動子能較好地克服位置效應,實現帶增強子的表達載體在不同單克隆細胞中較為穩定表達的原因。

4 結論

啟動子上的CpG島能克服轉基因沉默效應,增強子能夠較好地克服位置效應。高效穩定表達的CMV啟動子同時帶增強子和CpG島;但CMV基因啟動子中增強子和CpG島的協調并不完美,增強子可能具有抵消CpG島克服轉基因沉默效應的能力。因此,如何在啟動子上進一步優化布局,既能避免增強子對CpG島的克服轉基因沉默效應能力的削弱,又能發揮增強子和CpG島協同增強的克服位置效應能力,值得更深入地研究和探討。