隱丹參酮治療小鼠非酒精性脂肪性肝病效果及機制研究

趙夢溪,羅 斌,呂建瑞,王 寧

(西安交通大學第二附屬醫院,陜西 西安 710004)

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是臨床中較為常見的代謝綜合征。近年來,NAFLD的發生率逐漸升高,已經成為人們亞健康狀態的疾病之一[1]。“二次打擊”或“多次打擊”是NAFLD目前公認的核心發生機制,其本質與肝臟脂質代謝異常密切相關。在脂質代謝過程中,脂肪酸α-氧化和β-氧化研究最為廣泛。脂肪酸α-氧化主要涉及肝臟脂肪酸的合成,脂肪酸β-氧化主要涉及肝臟脂質的分解代謝[2-3]。隱丹參酮是一種從丹參酮中獲得的有效藥理成分單體,具有優秀的抗炎、抗菌及降溫能力[4]。目前,隱丹參酮已經應用于冠心病及肝炎的治療中[5-7],但還沒有其用于治療NAFLD的相關研究。因此,本研究探討不同劑量隱丹參酮對NAFLD的治療效果及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級雄性C57BL/6小鼠60只,均為6 周齡,體重18～22 g,購自西安交通大學醫學部動物實驗中心,生產許可證號:SCXK(陜)2020-001。飼養環境由中央空調統一控制,溫度為22～24 ℃,濕度40%～60%,光照/黑暗為12 h/12 h,自由進食和飲水,適應性喂養1周。本研究獲本院實驗動物倫理委員會授權。

1.2 主要藥物與試劑 隱丹參酮(質量分數98%,貨號:35825-57-1,上海同田生物技術有限公司);10%的低脂飼料和45%的高脂飼料(江蘇美迪森生物醫藥公司);谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒(貨號:C010-2-1、C009-2-1、A111-1-1、A110-1-1、A112-1-1、A113-1-1、A001-3-2、A003-1-2、A006-1-1,南京建成生物工程研究所);腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和IL-6 ELISA檢測試劑盒(貨號:CSB-E04741m、CSB-E08054m、CSB-E04639m,武漢華美生物科技有限公司);BCA蛋白定量分析試劑盒(貨號:G2026-1000T,武漢賽維爾生物工程有限公司);ECL發光液(貨號:34578,賽默飛世爾科技中國公司);過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)、過氧化物酶?；o酶A氧化酶1抗體(ACOX1)(貨號:sc-13551、sc-398394,美國Santa Cruz Bicycles公司);肉堿棕櫚酰轉移酶1(CPT1)一抗(貨號:ab189182,美國ABCAM公司);辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗 (貨號:BA1066,武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 主要儀器與設備 精密電子天平(型號:WT20003型,常州萬泰天平儀器有限公司);化學發光成像系統(型號:ChemiDoc XRS+型,美國Bio-Rad Laboratories公司);酶標儀(型號:BIO-DL K3 Plus型,上海素秋儀器設備有限公司);低溫高速離心機(型號:MULTIFUGF X1R型,德國Heraeus公司);超低溫冰箱(型號:MDF-U53V型,日本三洋公司);組織石蠟包埋機(型號:ES500型,美國Them Fisher Scietific公司);冰凍組織切片機(型號:CM 1860型,德國Leica公司);石蠟切片機(型號:HM 325型,美國Them Fisher Scietific公司);實驗室熒光顯微鏡(型號:FCK-40C型,上海蔡康光學儀器廠);常規垂直電泳儀(型號:Mini-PROTEAN型,美國Bio-Rad公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組與給藥:將60只小鼠根據隨機數字法分為兩組,其中正常組12只(普通飼料喂養),造模組48只(高脂高糖飼料喂養)。8周后,正常組隨機處死2只,造模組隨機處死8只檢驗造模是否成功(本研究NAFLD模型均構建成功)。造模成功后,隨機將造模組小鼠分為模型組和隱丹參酮低、中和高劑量組,每組10只。正常組和模型組給予1 ml/(kg·d) 0.9%氯化鈉溶液腹腔注射,隱丹參酮低、中和高劑量組分別給予7.5、15、30 mg/(kg·d)隱丹參酮腹腔注射,4周后進行后續實驗。

1.4.2 實驗樣本采集:4周后,所有實驗小鼠禁食不禁水12 h,于次日腹腔注射1%戊巴比妥鈉12 ml/kg進行麻醉,麻醉后固定于解剖板,暴露腹腔,找到腹主動脈后用5 ml注射器采集小鼠血液。采用低溫高速離心機離心血液(3000 r/min離心10 min)并收集血清,保存至超低溫冰箱中用于后續檢測。此外,收集血液后,快速分離小鼠肝臟組織,將其表面血液處理干凈后用于后續HE染色、油紅O染色、相應生化指標檢測及相關蛋白表達檢測。

1.4.3 小鼠一般情況記錄:在喂養周期內,每日觀察記錄小鼠的日?；顒印⒚l特點以及飲食變化量。同時每周稱重小鼠1次,同時進行相應的藥物計算,以確定每周的給藥量。

1.4.4 血清AST和ALT檢測:將血清嚴格按照試劑盒說明書進行檢測,得到吸光度值后計算AST和ALT含量。

1.4.5 肝臟組織生化指標檢測:稱取100 mg肝臟組織,用組織提取液提取并收集上清液,定量并調平后使用相應的試劑盒檢測TG、TC、HDL-C、LDL-C、SOD、MDA、GSH、TNF-α、IL-1β和IL-6。

1.4.6 肝臟組織病理學染色:①將肝臟組織固定24～72 h后取出并清洗,用梯度乙醇浸潤并脫水,二甲苯溶液處理后采用石蠟包埋法制作石蠟塊,并切成3～5 mm薄片。將切片脫蠟處理后進行HE染色,采用光學顯微鏡收集圖像,每張切片選取4個不同視野。②將肝臟組織用包埋劑包埋后連續切成厚度為10 μm的薄片,用組織固定液固定10 min后用超純水洗滌,油紅O染色封片后收集圖像,每張切片選取4個不同視野。

1.4.7 肝臟組織蛋白表達水平檢測:稱取100 mg肝臟,用組織裂解液裂解后提取上清液,測定蛋白濃度并調平。每組取50 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳,電泳條件:80 V恒壓電泳30 min;120 V恒壓電泳60 min。電泳結束后,將目的蛋白用半干轉移法轉移到PVDF膜,選用5%脫脂牛奶進行封閉,一抗過夜孵育、二抗孵育,ECL發光液反應后用凝膠成像儀成像。計算CPT1、ACOX1以及PPARα蛋白的表達水平。

2 結 果

2.1 各組小鼠一般情況 正常組小鼠毛色光滑且有光澤,精神活躍。模型組小鼠毛色枯糙暗淡,體重前期增加快,后期增加慢,活動明顯減少,且墊料在后期明顯潮濕發臭。與模型組比較,隱丹參酮低、中和高劑量組小鼠一般情況均有好轉。

2.2 各組小鼠肝臟組織染色結果 見圖1。HE染色結果顯示:正常組肝臟組織可見完整的小葉結構和均勻分布的肝細胞,肝細胞核多數位于細胞中央,偶爾出現空泡;模型組肝臟組織可見大量脂肪空泡;與模型組比較,隱丹參酮低、中和高劑量組肝臟組織病變有不同程度好轉。油紅O染色結果顯示:正常組肝臟組織幾乎未見脂滴;模型組肝臟組織出現大量脂滴且呈彌漫性分布;與模型組比較,隱丹參酮低、中和高劑量組脂滴數量均有不同程度降低。

圖1 各組肝臟組織病理學HE、油紅O染色結果(×400)

2.3 各組小鼠血清AST和ALT水平比較 見表1。與正常組比較,模型組小鼠AST和ALT水平升高(均P<0.05)。與模型組比較,隱丹參酮低、中和高劑量組AST和ALT水平降低(均P<0.05)。

表1 各組小鼠血清AST和ALT水平比較(U/L)

2.4 各組小鼠肝臟組織脂代謝指標比較 見表2。與正常組比較,模型組LDL-C、TG和TC水平升高,HDL-C水平降低(均P<0.05)。與模型組比較,隱丹參酮低、中和高劑量組LDL-C、TG和TC水平降低,HDL-C水平增加(均P<0.05)。

表2 各組小鼠肝臟組織脂代謝指標比較(mmol/L)

2.5 各組小鼠肝臟組織氧化應激指標比較 見表3。與正常組比較,模型組SOD和GSH水平降低,MDA水平升高(均P<0.05)。與模型組比較,隱丹參酮低、中和高劑量組SOD和GSH水平升高,MDA水平降低(均P<0.05)。

表3 各組小鼠肝臟組織氧化應激相關指標比較

2.6 各組小鼠肝臟組織炎性指標比較 見表4。與正常組比較,模型組TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高(均P<0.05)。與模型組比較,隱丹參酮低、中和高劑量組TNF-α、IL-1β和IL-6水平下降(均P<0.05)。

表4 各組小鼠肝臟組織炎性指標比較(ng/L)

2.7 各組小鼠肝臟組織脂肪酸β-氧化調節酶表達水平比較 見表5。與正常組比較,模型組肝臟組織中PPARα、CPT1和ACOX1表達水平降低(均P<0.05)。與模型組比較,隱丹參酮低、中和高劑量組肝臟組織中PPARα、CPT1和ACOX1表達水平升高(均P<0.05)。

表5 各組小鼠肝臟組織脂肪酸β-氧化調節酶表達水平比較

3 討 論

NAFLD的發生是一個復雜的過程,“二次打擊”和(或)“多次打擊”學說能夠較為全面地闡述本病的發生和發展,是目前國內外相關學者接受度較高的機制學說。兩種學說幾乎都離不開NAFLD發生的本質,即肝臟的脂肪變性以及脂肪細胞在肝臟中過量蓄積[8-9]。肝臟脂質的蓄積是NAFLD發展的第一步。相關研究[10]表明,在NAFLD中,肝臟脂質蓄積的主要原因為脂肪生成增加(即脂肪酸α-氧化)和肝臟中脂肪酸β-氧化減少。脂質長期蓄積可引起肝臟脂質和相關碳水化合物的異常,長期存在可引起肝細胞炎癥反應和氧化應激的發生,進而加重NAFLD,導致肝纖維化甚至肝硬化的發生[11-13]。因此,目前國內外學者對NAFLD治療的研究重心轉到減少脂質合成或促進脂肪分解代謝兩個方面[14-15]。本實驗重點研究增強脂肪酸β-氧化方面。

研究[16]表明,中藥天然化合物可能能夠作為脂肪酸β-氧化的靶點。例如,田香[17]分別構建了NAFLD的細胞和動物模型,觀察梓醇對NAFLD脂肪酸β-氧化信號通路的影響,發現梓醇能夠明顯調節脂肪酸β-氧化信號通路蛋白ACC、PPARα、CPT1和ACOX1等的表達,進而調節肝細胞脂質代謝,減輕肝臟負擔,預防脂肪肝。此外,廖文云等[18]構建了NAFLD小鼠模型,發現人參皂苷Rg1對脂肪酸β-氧化信號相關蛋白具有明顯的調節作用。

隱丹參酮是中藥丹參的主要成分。由于隱丹參酮在丹參中含量較低,所以目前缺少將其用于治療NAFLD的研究。然而,有較多研究報道[19-21]其中藥植株及中藥提取物對NAFLD有治療作用。本研究中,肝臟組織HE染色結果顯示模型組肝臟組織可見明顯的脂肪空泡。與正常組比較,模型組血清AST和ALT水平升高,肝臟組織LDL-C、TG和TC水平升高,HDL-C水平降低。而給予隱丹參酮治療后,肝臟組織染色提示,脂肪空泡明顯變小且數量減少,脂肪浸潤均有不同程度降低。與模型組比較,血清AST和ALT水平降低,肝臟組織LDL-C、TG和TC水平降低,HDL-C水平升高,證明了隱丹參酮對NAFLD有治療作用。

在脂肪酸β-氧化過程中,PPARα、CPT1和ACOX1是其中的三個核心蛋白酶。PPARα是機體內重要的轉錄因子,可以控制脂肪酸氧化酶ACOX1基因表達,通過激活ACOX1的表達促進脂肪酸的分解,而在此過程中脂肪酸β-氧化的關鍵調節酶和限速酶能夠平衡脂肪酸β-氧化,維持β-氧化的穩態[22]。本研究結果發現,與正常組比較,模型組小鼠PPARα、CPT1和ACOX1蛋白表達水平降低,證實NAFLD存在脂肪酸分解異常。采用隱丹參酮治療后,肝臟組織中PPARα、CPT1和ACOX1蛋白表達水平較模型組升高,表明隱丹參酮能夠促進肝臟脂肪酸β-氧化,進而改善脂肪顆粒在肝臟中蓄積。

為準確地評估隱丹參酮對NAFLD的治療作用,本研究也觀察了隱丹參酮對炎癥反應和氧化應激相關因子的變化特點。觀察這兩類指標,主要是因為在NAFLD發生和發展過程中炎癥反應和氧化應激參與了“二次打擊”或“多次打擊”的過程,是NAFLD進展的關鍵指標[23]。本研究發現,模型組小鼠TNF-α、IL-1和IL-6水平顯著高于正常組,而氧化應激相關指標中MDA水平較正常組升高,抗氧化應激指標SOD和GSH水平降低。采用隱丹參酮治療后,TNF-α、IL-1、IL-6以及MDA水平較模型組降低,而SOD和GSH水平升高,提示隱丹參酮能改善NAFLD的炎癥反應,也能平衡氧化應激,進而保護肝臟。

綜上所述,隱丹參酮對NAFLD具有治療作用,能夠改善脂質代謝,促進肝臟脂質排出,改善肝功能和減少肝臟脂質沉積,其機制可能與調節脂肪酸β-氧化、減輕炎癥反應及平衡氧化應激有關,但具體機制仍需后續進一步實驗研究。