潰瘍性結腸炎與NLRP3/CARD8基因多態性的相關性分析

楊青華,郭茂東

(1.磐安縣人民醫院 消化內科,浙江 磐安 322399;2.金華市中心醫院 消化科,浙江 金華 321000)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)指的是一種結腸慢性免疫介導的炎性疾病,表現為反復發作或遷延不愈的腸道黏膜慢性炎癥病變,由直腸黏膜受累起始,可倒灌累及近端結腸。其發生原因可能與腸道免疫功能障礙、環境及遺傳等因素相關[1]。UC具有終身復發性的特點,患者需長期隨診,目前臨床上治療UC以誘導和維持為主,內鏡下緩解作為治療目標。輕中度UC患者以5-氨基水楊酸為首要誘導緩解治療的藥物,但病變范圍局限于直腸[2];中重度UC患者以口服糖皮質激素并早期聯合硫唑嘌呤(AZA)誘導緩解為主要手段,可增加無激素臨床緩解率和黏膜愈合率,但AZA可能導致患者發生白細胞減少癥,存在潛在的嚴重不良反應,其安全性尚存在爭議。

有研究[3]指出,Nod樣受體蛋白3(NLRP3)基因rs10754558多態性可能對NLRP3炎性體的功能具有一定的影響,且與冠狀動脈病變嚴重程度、艾滋病、過敏反應、缺血性心臟病發病等相關。炎癥小體組分基因胱天蛋白酶募集域蛋白8(CARD8)則是NLRP3炎性體的重要組成蛋白,可介導IL-1β的活化,現已被證實與炎性腸病、痛風、腹主動脈瘤等疾病密切相關[4]。本研究以潰瘍性結腸炎患者作為研究對象,探討UC與NLRP3/CARD8基因多態性的相關性,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象一般資料 納入2019年6月—2020年6月于磐安縣人民醫院就診的96例中國籍潰瘍性結腸炎患者作為研究對象(UC組),另選取96例非潰瘍性結腸炎患者作為對照組。對照組中,男56例,女40例;年齡20～75歲,平均(46.87±4.83)歲;UC組中,男53例,女43例,年齡21～74歲,平均(47.13±4.65)歲;2組一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。本研究已獲得磐安縣人民醫院醫學倫理委員會批準同意。

1.2 診斷標準 潰瘍性結腸炎診斷缺乏金標準,入組患者參考《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2018年·北京)》[5]中潰瘍性結腸炎的相關診斷建議進行綜合分析,包括①臨床表現:青壯年期發病,持續或反復發作的腹瀉、黏膜膿血便伴腹痛、里急后重和不同程度的全身癥狀,病程在4周以上;②內鏡檢查:結腸鏡下潰瘍性結腸炎病變從直腸開始,呈連續性、彌漫性分布。輕度炎癥可見紅斑、黏膜充血和血管紋理消失;中度可見血管形態消失,出血黏附在黏膜表面、糜爛,常伴有粗糙呈顆粒狀的外觀及黏膜脆性增加;重度可見黏膜自發性出血及潰瘍;③組織學活檢:活動期固有膜內彌漫性、急性/慢性炎性細胞浸潤,隱窩結構改變,黏膜糜爛;緩解期黏膜糜爛或潰瘍愈合,固有膜內中性粒細胞浸潤減少或消失,慢性炎性細胞浸潤減少,隱窩結構改變可保留。

對照組非潰瘍性結腸炎診斷標準:參照《中藥(新藥)治療慢性非特異性潰瘍性結腸炎的臨床研究指導原則》中相關診斷標準,即伴有以臍周為主的反復慢性腹痛、糞便有時溏薄有時干結或帶有黏液;結腸鏡檢查下可見黏膜水腫充血,黏膜血管紋路紊亂、模糊,甚至消失;病變部位:直腸、左半直腸。

1.3 研究對象選取標準 納入標準:各組患者情況符合上述相應診斷建議;同意接受AZA治療,愿意配合后續隨訪工作;知情同意。排除標準:合并嚴重心、腎、肝功能不全的患者,確診為淋巴瘤或癌癥的患者,合并活動性肺結核及活動性病毒性肝炎的患者。

1.4 基因位點檢測及分型

1.4.1 DNA提取 采集入組患者2 mL空腹外周肘靜脈血作為檢測標本,根據DNA提取試劑盒說明書進行全基因組DNA提取,稀釋至10 ng/μL后保存于-20 ℃環境中備用。試劑盒購自上海萊楓生物科技有限公司。

1.4.2 DNA擴增 根據美國NCBI數據庫檢索結果,采用引物設計軟件Primer 5.0設計引物,CARD8引物序列:正向為5’-AGTTGACACTAGGAACAGCACGGA-3’,反向為5’-CAATAATGGCTCTGCCTCTGTCTCA-3’;NLRP3引物序列:正向為5’-CCTGAGCTGACCGTCGTCTT-3’,反向為5’-ATGAGGTCACCAAGAGGAACATC-3’。嚴格根據引物說明書要求對引物進行稀釋,得到引物工作溶液后將其置于-20 ℃恒溫冰箱中保存備用。于PCR反應前提前取出引物置于4 ℃水浴中復溫融化。

1.4.3 基因分型 采用探針法熒光定量PCR檢測樣本兩個不同位點的基因型,每個位點分別進行PCR反應,并應用ABI7900HT Fast Real-Time PCR System自帶軟件對讀取的基因分型。

1.5 治療方法 UC組患者均采用AZA聯合潑尼松龍治療,AZA使用劑量為每天1.5 mg/kg,潑尼松龍使用劑量為每天1 mg/kg,臨床癥狀控制后逐漸減少糖皮質激素用量至停藥,治療時間為6個月。

1.6 觀察指標

1.6.1 NLRP3和CARD8不同位點的基因型和等位基因頻率分布 記錄NLRP3和CARD8不同位點的基因型,統計各基因型的分布頻率。

1.6.2 療效 治療結束后,評估療效,分為緩解、有效和無效。緩解:便血等臨床癥狀消失,大便次數減少,糖皮質激素停用或減量,結腸鏡檢查黏膜正常。有效:便血等臨床癥狀基本消失,大便次數減少,糖皮質激素減量,結腸鏡檢查黏膜輕度炎癥。無效:便血等臨床癥狀未見好轉,大便次數增多,糖皮質激素用量不變,結腸鏡或病理檢查病灶加重或未改變。

1.7 統計學方法 應用SPSS 22.0統計分析軟件。各基因型的分布頻率及療效用[n(%)]表示,組間比較采用χ2檢驗;P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 NLRP3基因型及分布頻率 NLRP3基因位點rs10754558包含CC、CG、GG 3種基因型,2組的各基因型分布頻率見表1。與對照組比較,UC組的CC基因型和C等位基因頻率降低,CG、GG及G等位基因型頻率增加,差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 兩組 NLRP3基因型和等位基因的分布頻率[n(%)]Table 1 Distribution frequencies of NLRP3 genotypes and alleles in the two groups [n(%)]

2.2 CARD8基因型和等位基因分布頻率 CARD8基因rs2443211位點包括AA、AT、TT3種基因型,各基因型分布頻率見表2。UC組AA基因型和A等位基因頻率較對照組降低,AT、TT及T等位基因頻率升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組CARD8 rs2443211位點基因型和等位基因頻率分布[n(%)]Table 2 Distribution frequencies of CARD8 rs2443211 genotypes and alleles in the two groups [n(%)]

2.3 治療前后不同基因型患者的潰瘍性結腸炎療效 UC組患者接受AZA治療后,共有74例患者得到緩解,緩解率為77.08%。觀察不同基因型患者的療效,結果顯示:NLPR3 CC基因型患者的緩解率(90.54%)高于CG、GG基因型患者(40.00%、25.00%),CARD8 AA基因型者的緩解率(80.77%)高于AT、TT基因型患者(36.67%、14.29%),差異均有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

AZA作為一種抗代謝型免疫抑制劑,對緩解潰瘍性結腸炎和維持治療效果有一定的作用。但AZA的相關不良反應(如白細胞減少和胃腸道反應等)則可能會誘發感染,進而對患者的生命安全造成威脅,導致患者治療中斷[6-8]。NLRP3、CARD8基因多態性可能與類風濕性關節炎、缺血性心臟病及Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病等多種存在長期炎癥反應的疾病相關[7],其機制可能為CARD8 rs204311的小等位基因可形成終止密碼,使得表達CARD8蛋白功能缺失,繼而使得Pro-IL-1β過量分泌,而NLRP3 rs1-754558的“功能獲得性”小等位基因可促使Pro-IL-1β轉化為成熟的IL-1β,引發炎癥反應。

本研究結果顯示:與對照組比較,UC組NLRP3基因位點rs10754558的CC基因型和C等位基因頻率降低,CG、GG及G等位基因型頻率增加;CARD8基因rs2443211位點的AA基因型和A等位基因頻率降低,AT、TT及T等位基因頻率升高。說明NLRP3、CARD8基因多態性在潰瘍性結腸炎的發病過程中發揮重要功能,可能影響潰瘍性結腸炎的易感性。分析原因可能與rs10754558多態性影響NLRP3炎性組分的表達,從而參與調解潰瘍性結腸炎患者的免疫及炎癥反應。NLRP3基因rs10754558位點CC基因、CARD8基因rs2443211位點AA基因很可能屬于潰瘍性結腸炎的易患因素[9],后期可進一步研究其在潰瘍性結腸炎發病機制中的作用。本研究結果還顯示,NLPR3 CC基因型患者的腸壁炎性反應緩解率明顯高于CG、GG基因,CARD8 AA基因型腸壁炎性反應緩解率較AT、TT基因型升高。可見,NLPR3 CC基因、CARD8 AA基因可影響患者的腸壁炎性反應緩解率。

綜上所述,NLRP3/CARD8基因多態性均對潰瘍性結腸炎患者易感性有一定的影響,且有望成為輔助臨床預測潰瘍性結腸炎患者預后療效的參考指標。