尿液中環境內分泌干擾物暴露水平檢測方法建立及應用

周 芳,黃 芳,劉 杰,歐陽械華,馬 良,陳 佳

(1.諸暨市中醫醫院 兒科,浙江 紹興 311800;2.杭州漢庫醫學檢驗所有限公司,浙江 杭州 310051)

環境內分泌干擾物(environmental endocrine disruptors,EEDs)是指能夠干擾人體內分泌系統的外源性化學物質,能被人體吸收,并且會通過食物鏈不斷富集,導致人的生殖系統、內分泌系統、神經系統、免疫系統等出現多種病變、癌變、畸變,對人體健康危害極大,尤其是嬰兒、幼兒、兒童,可能造成不可逆的身體損害,例如性早熟、肥胖、發育遲緩等[1-5],環境內分泌干擾物暴露已成為人們日益關注的重大環境問題,因此建立環境內分泌干擾物質的快速準確檢測方法尤為重要。

目前關于人體EEDs暴露水平檢測的文獻報道較多[6-12],但存在檢測物質種類較少、實際樣本檢測數量少、未實際應用于臨床等問題。本文建立方法同時檢測尿液中15種EEDs,包括防腐劑、鄰苯二甲酸酯類化合物、雙酚類化合物、烷基酚類化合物、激素類藥物殘留,涵蓋目前主要暴露EEDs類別中的主要物質,并應用于614例0～12歲人群臨床尿液樣本的檢測,以期為臨床診斷及暴露預防提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 鄰苯二甲酸甲酯、鄰苯二甲酸丁酯、鄰苯二甲酸乙基己基酯、雙酚A 、雙酚B、辛基酚、壬基苯酚 、己烯雌酚、17α-乙炔基雌二醇、對羥基苯甲酸丁酯、雙酚A-d6、鄰苯二甲酸甲酯-d4(德國Dr.Ehrenstorfer公司,純度均大于98%),鄰苯二甲酸乙酯(美國AccuStandard公司,純度99.7%),對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯(法國EXTRASYNTHESE公司,純度均大于98%),對羥基苯甲酸乙酯-d4、雙酚B-d8(加拿大TRC公司,純度均大于98%),4-辛基酚-d17、α-乙炔雌二醇-d4(加拿大CDN公司,純度均大于98%)。

1.2 儀器條件及參數 定量檢測采用Agilent 1290-AB Sciex 5500 超高效液相色譜串聯質譜儀(美國安捷倫公司-美國AB SCIEX公司)。液相色譜條件:Acquity UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,美國沃特斯公司);流動相為0.1%乙酸/水溶液-0.01%氨水/乙腈溶液,進樣量為5 μL,流速為0.4 mL/min,柱溫為45 ℃,流動相B,0～2.0 min,5%～60%,2.0～3.0 min,60%～65%,3.0～3.5 min,65%～95%,3.5～5.0 min,95%～100%,5.0～5.1 min,100%～5%,5.1～6.0 min,5%～5%。質譜條件:電噴霧離子源(ESI),負離子檢測模式,Curtain Gas(CUR) 20 psi,Collision Gas (CAD) 9;IonSpray Voltage (IS) -4 500 V,Temperature(TEM) 400 ℃;Ion Source Gas 1 (GS1) 45,Ion Source Gas 1 (GS2) 45,MRM檢測方式。質譜檢測參數如表1所示。

表1 15種環境內分泌干擾物質譜參數Table 1 MS parameters of 15 environmental endocrine disrupting substances

1.3 校準曲線的配制 環境內分泌干擾物標準品用甲醇(含1 mg/mL BHT)配制成1 mg/mL的一級標準儲備液,分別取適量標準儲備液,配制成100 μg/mL的混合標準儲備液,繼續稀釋成5 μg/mL的混合標準工作液,然后用2 mol/L乙酸銨水溶液逐級稀釋成濃度分別為0.1、0.5、2.5、5、25、50、100 ng/mL的校準曲線溶液。

1.4 樣本前處理 取500 μL尿液樣本于2.0 mL離心管內,加入100 μL 2 mol/L乙酸銨溶液(pH=6.5)、20 μL混合內標工作液、20 μL β-葡萄糖醛酸苷酶,渦旋混勻,37 ℃水浴振蕩振蕩90 min;酶解液冷卻至室溫,加20 μL甲酸,并加入1 mL乙酸乙酯萃取;取950 μL乙酸乙酯層凍干,用100 μL甲醇復溶,離心取上清液進樣分析。

2 結果與討論

2.1 典型分析譜圖 15種環境內分泌干擾物標準物質和尿液樣本檢測譜圖見圖1。各物質的保留時間(min)分別為:MMP 2.04,MP 2.26,MEP 2.28,EP 2.55,BPA 2.79,MBP 2.80,PP 2.83,MBzP 2.83,EE2 2.97,BPB 2.98,BP 3.12,DES 3.12,MEHP 3.92,4-OP 4.44,4-NP 4.58。

圖1 標準品(A)及尿液樣本(B)的UPLC-MS/MS檢測選擇離子流圖Figure 1 Selected ion chromatogram of standard solution (A) and urine sample (B) by UPLC-MS/MS Detection

2.2 線性范圍、回歸方程及檢出限和定量限 配制濃度分別為0.1、0.5、2.5、5.0、25.0、50.0、100.0 ng/mL的15種EEDs的校準曲線溶液,按照1.4方法進行前處理后進樣分析,采用內標法定量,15種EEDs的線性相關系數均大于0.999。以3倍信噪比對應的含量為檢出限,以10倍信噪比對應的含量為定量限,尿液種15種EEDs的線性、方法檢出限和定量限如表2所示。

表2 15種EEDs的線性、檢出限和定量限實驗結果Table 2 The results of linearity, detection limit, and quantification limit for 15 EEDs

2.3 方法精密度和準確性 在尿液樣本中分別加入低、中、高3個濃度的15種EEDs混合標準物質,加標濃度分別為 2.5、25、75 ng/mL,每個濃度平行6次實驗,連續測試3天,15種EEDs檢測含量的日內精密度均小于10%,日間精密度均小于15%,加標回收率均在80%～120%之間,表明分析結果穩定可靠。

2.4 臨床樣本分析 收集2018年度于本院兒科就診的614例12歲及以下人群的尿液樣本,采用本研究建立的方法進行測試。樣本來源病例均表現出相關臨床癥狀就醫、可能為EEDs暴露者,其中:男44例,包括0～3歲4例、4～6歲27例、7～9歲13例、10～12歲26例;女570例,包括0～3歲19例、4～6歲155例、7～9歲396例、10～12歲18例。檢測樣本來源說明出現臨床癥狀就醫的女童數量遠高于男童,4～9歲為高發期;在男童和女童所有年齡段中,MP、EP、MMP、MEP、MBP、MEHP檢出率為75%～100%,PP檢出率為53.85%～96.3%,BPA檢出率為25%～56%,MBzP檢出率為5.88%～87.88%,BPB、DES、EE2、4-OP、4-NP幾乎沒有檢出。

3 討論

隨著人類社會生產力水平不斷提高,人們日常生活中接觸到工業制品的機會愈來愈多。而眾多工業制品中往往含有一些危害人體健康的物質,其中環境內分泌干擾物(EEDs)就是其中重要的一類。近年來,越來越多的研究開始關注這些EEDs的暴露對人體健康所造成的危害。值得關注的是,與國外調查數據相比較發現,我國人體中鄰苯二甲酸甲基酯(MMP)和鄰苯二甲酸單(2-乙基己)酯(MEHP)的檢出率和含量都非常高,毒性較大的MEHP含量高出國外的2～100倍,分析可能與我國大量生產和使用增塑劑有關。國內學者王小逸等[13]在對北京地區家庭中鄰苯二甲酸酯類化合物暴露情況的調查發現,與飲用水相關的塑料來自水管和桶裝水,分別占到64%和41%;擁有兒童的家庭中,使用塑料餐具和奶瓶的,占總的兒童家庭的44%和41%。EEDs系列分析可了解日常生活中環境內分泌干擾物的暴露量,如個人衛生用品、塑料食品容器與清潔劑等。因此,評估體內EEDs是幫助患者恢復健康的第一步。

質譜檢測方法能夠在色譜峰不完全分離的情況下基于質荷比進行準確的定性定量,本文建立了尿液中15種EEDs的超高效液相色譜串聯質譜檢測方法,6 min內即可實現15種常見EEDs的同時檢測,分析通量高,適用于大樣本篩查,所使用尿液樣本僅為500 μL,前處理操作簡便且靈敏度高,實現了體內暴露的EEDs代謝物質的精準檢測。而且,同時檢測尿中EEDs具有不受外源性污染、采樣無人體損傷、采樣量足、兒童及家長容易接受的特點。盡管尿中環境激素代謝物的濃度存在一些日間或月間變異,但研究表明檢測單份隨機尿可以代表6個月內環境激素的平均暴露水平。該方法的建立有助于評估兒童體內環境激素的污染水平,指導家長更加科學地撫養兒童。另外,本研究將該方法應用于臨床尿液樣本的檢測,樣本來源說明出現臨床癥狀就醫的女童數量遠高于男童、4～9歲為高發期;檢測結果表明MP、EP、PP、MMP、MEP、MBP、MEHP 7種物質檢出率很高,均達到90%以上。該檢測結果可對有針對性地預防暴露,以及降低發病率提供科學依據。

環境內分泌干擾物在體內呈累積趨勢,因此對未出現臨床癥狀人群的篩查尤為重要;做到早發現、早干預,降低不可逆身體損害的發生概率,需要建立快速、簡便、高通量的檢測方法進行人群篩查。今后,疾病機理的研究、治療過程的監測及治療手段的發展是環境內分泌干擾物分析研究的方向。