乙型肝炎病毒相關肝細胞癌癌組織ARHGAP18水平及其基因調控網絡分析*

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的原發性肝癌類型。在世界范圍內,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是HCC的主要病因。近年來,盡管分子靶向治療和免疫治療等新的治療方法不斷出現并逐步應用于臨床,HCC患者5 a總體生存期(overall survival,OS)并不理想[1]。因此,在分子水平上更好地了解HBV相關HCC(HBV-HCC)的發病機制可以促進新的診斷和治療方法的開發。細胞衰老是指由多種因素,如DNA損傷、原癌基因異常激活等誘發,使增殖細胞發生周期停滯的一種機制。越來越多的研究證據表明,衰老細胞在腫瘤發生發展過程中具有重要的作用。衰老細胞在腫瘤組織內大量累積,分泌多種炎癥細胞因子和蛋白酶等,又被稱為“衰老相關的分泌表型”(senescence-associated secretory phenotype,SASP)[2,3]。SASP可以通過維持干細胞特征、創造免疫抑制環境、誘導耐藥性產生等方式,促進腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移[4]。ARHGAP18基因是一個細胞衰老相關基因,通過誘導細胞衰老和抗炎表型,調節細胞增殖和凋亡,參與了多種疾病的發生發展過程[5-7]。目前,關于ARHGAP18基因是否參與HBV-HCC的發生和進展,尚無相關報道。本研究評估了數據庫HBV-HCC癌組織ARHGAP18水平變化,從轉錄組和甲基化層面探索了ARHGAP18水平與HCC發生的分子機制,為其作為HCC潛在的治療靶點和預后指標提供證據。

1 資料與方法

1.1 數據集獲取 從基因表達數據庫(gene expression omnibus,GEO)中獲得GSE55092、GSE62232、GSE77276和GSE83148共4個公開數據集。在GSE83148數據集,使用基因芯片(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)對122例HBV感染者肝組織(HBsAg或血清HBV-DNA陽性)和6例正常肝組織進行RNA水平分析;GSE62232數據集使用同樣的基因芯片,對81例HCC患者腫瘤組織和10例正常肝組織進行RNA水平分析;GSE55092數據集使用同樣的基因芯片研究HBV-HCC患者整個肝臟分子異質性。研究者在11例HCC患者獲得了120份樣本,其中39份來自腫瘤中心或腫瘤外圍,81份來自癌旁組織;GSE77276數據集是HCC患者的多組學分析數據集,使用高通量測序和基因芯片對19例HCC患者腫瘤組織、癌旁組織和門靜脈血栓進行拷貝數變異、DNA 甲基化、微小RNA和轉錄組分析。

1.2 差異表達基因分析 以ARHGAP18水平中位數作為截斷點,將GSE77509中HBV-HCC患者分為高水平組和低水平組。應用R軟件進行繪圖和統計學分析。應用Limma包分析ARHGAP18高水平組與低水平組間差異表達的基因[8]。P<0.05且log2FC> 1被認為是鑒定差異基因表達的閾值。

1.3 功能富集分析 對差異表達基因(DEmRNA)進行注釋,應用基因注釋和分析數據庫(Metascape,https://metascape.org/)進行功能富集分析,包括GO途徑分析[9]。

1.4 甲基化分析 應用ChaMP包對Illumina公司Human Methylation 450K甲基化芯片進行數據分析[10]。通過β值鑒定每個樣品的差異甲基化探針(DMP),P<0.05且|△β|> 0.1被認為是鑒定差異甲基化位點的閾值。

1.5 UALCAN在線分析 UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)系應用癌癥基因組圖譜(TCGA)轉錄組數據和來自31種癌癥類型的臨床數據,可對TCGA基因數據進行深入分析[11]。應用UALCAN分析不同臨床和病理學特征的HCC組織ARHGAP18相對水平以及對預后的影響。

1.6 GEPIA在線分析 基因表達譜交互分析網站是一個基于TCGA和基因型-組織表達計劃(GTEx)數據提供快速且可自定義功能的在線網站[12]。GEPIA可以提供關鍵的交互式和可自定義功能,包括差異表達分析、相似基因檢測和降維分析。

2 結果

2.1 HBV-HCC ARHGAP18水平異常升高 為了解ARHGAP18是否參與了HBV-HCC發生發展,我們應用4個GEO數據集從不同角度比較了ARHGAP18的水平變化。在GSE83148數據集,發現HBV感染者肝組織ARHGAP18 RNA水平為(5.62±0.66),顯著高于正常肝組織[(5.04±0.21),P<0.05];在GSE62232數據集,發現HBV-HCC腫瘤組織ARHGAP18水平為(77.20±50.82),顯著高于正常肝組織[(20.00±5.52),P<0.05];在GSE77509數據集,發現HBV-HCC腫瘤組織ARHGAP18水平為(3988.63±1701.17),顯著高于癌旁組織[(1976.34±531.32),P<0.05];進一步比較距離HBV-HCC腫瘤中心不同距離組織ARHGAP18水平變化,發現在肝臟邊緣癌旁組織(37個樣本,區域1)、距腫瘤2～3 cm處癌旁組織(19個樣本,區域2)、腫瘤邊緣癌旁組織(25個樣本,區域3)、腫瘤外圍區域組織(26個樣本,區域4)和腫瘤中心區域組織(13個樣本,區域5)ARHGAP18水平分別為(7.06±0.61)、(6.83±0.47)、(6.82±0.42)、(7.75±0.56)和(8.38±0.79),提示向腫瘤中心靠近時ARHGAP18水平存在異常升高的趨勢(P<0.05,圖1)。

圖1 距離HBV-HCC患者腫瘤中心不同位置ARHGAP18水平變化

2.2 不同臨床和病理學特征的HCC組織ARHGAP18水平變化 應用UALCAN在線分析網站進行TCGA-HCC數據分析,結果發現HCC組織ARHGAP18水平異常升高;不同腫瘤分期、腫瘤分級和TP53是否突變的HCC組織ARHGAP18水平存在顯著性差異;HCC組織ARHGAP18高水平者OS顯著縮短。

2.3 全基因組表達譜與ARHGAP18水平之間的關聯 對GSE77509數據集中轉錄組數據進行差異分析,以ARHGAP18水平中位數為截斷點將其分為高/低水平組,每組各9例,共鑒定出661個上調基因和330個下調基因(P<0.05,|log2FC|>1,圖2A);在上調基因中發現有抑制細胞凋亡基因(如CAPN6等)、HBV-HCC潛在標靶基因(PTN)、代謝異常相關基因(如GSTP1等);下調的基因中包括協調增殖停滯和肝細胞分化的重要轉錄因子(如CEBPA)、鈣粘蛋白家族基因(如CDH7和CDH12);應用Metascape在線數據庫進行差異基因功能富集分析,進一步探索在HBV-HCC發生和進展過程中重要的信號通路。GO生物學通路分析表明,差異表達的上調基因主要富集于炎癥相關途徑(如炎癥反應、炎癥反應的正調控、炎癥反應的調節等)、免疫相關途徑(激活免疫反應、免疫效應過程的調節、先天性免疫反應、適應性免疫反應等,圖2B);下調基因富集通路相對零散,主要富集于細胞形態發生、離子跨膜轉運等通路(圖2D)。令人感興趣的是,在ARHGAP18高水平組基因富集結果提示多條炎癥和免疫相關途徑被異常激活。應用GEPIA在線分析網站對TCGA中HCC數據進行ARHGAP18與CD274(PDL1)水平相關性分析,結果發現ARHGAP18與CD274水平呈正相關(圖2C)。

圖2 HCC組織ARHGAP18水平與全基因組轉錄組關聯A:ARHGAP18高低水平組差異基因火山圖;B:ARHGAP18高水平組上調的20條GO通路; C:TCGA-HCC組織ARHGAP18與CD274(PDL1)水平相關;D:ARHGAP18高水平組下調的20條GO通路

2.4 與ARHGAP18水平相關的全基因組甲基化改變情況 為鑒定ARHGAP18高/低水平組甲基化差異基因,對基因啟動子區域的全基因組DNA甲基化進行了分析。在405488個甲基化位點共確定了2603個差異甲基化位點(|△β|>0.1,P<0.05)。與ARHGAP18低水平組比,ARHGAP18高水平組中有1234個位點顯示出高甲基化,而1369個位點顯示為低甲基化;高甲基化基因富集于細胞形態發生和細胞周期的正調控等通路,而低甲基化基因富集于腺苷酸環化酶調節的G蛋白偶聯受體信號通路和Wnt信號通路的調控等通路;對轉錄組與甲基化數據聯合分析發現,有28個基因高表達/啟動子低甲基化,4個基因低表達/啟動子高甲基化,高表達/啟動子低甲基化基因包括免疫和炎癥相關因子TGFBI和CD40等。

3 討論

細胞衰老在腫瘤發生過程中起到至關重要的作用[13]。細胞衰老通過誘導細胞周期停滯和激活免疫監視可以在早期抑制腫瘤發生。然而,衰老細胞可以通過維持干細胞特征、創造免疫抑制環境、誘導耐藥性和刺激上皮間質轉化等,間接促進腫瘤細胞的生長、侵襲和轉移,給臨床早期診斷提出了很大的挑戰[14,15]。

ARHGAP18是近年來發現的與細胞衰老相關的基因。ARHGAP18也被稱為SENEX,是RhoGAP蛋白家族成員。該蛋白家族在調節小Rho GTP酶活性方面起作用。ARHGAP18對不同的Rho GTP酶表現出不同的特異性。在內皮細胞,ARHGAP18優先作用于RhoC[16],而在癌細胞,它主要對RhoA表現出特異性[17]。通過抑制RHoA信號,ARHGAP18可以在三陰性乳腺癌和肝細胞癌細胞促進腫瘤細胞轉移[18,19],并間接調控MAPK信號通路。

本研究表明,ARHGAP18在多個HBV-HCC的GEO數據集中水平異常升高,與疾病進展密切相關,并可能預測了不良的臨床結局。為了進一步探索ARHGAP18基因在HBV-HCC發生發展過程中的生物學作用,我們從轉錄組學等多個層面進行了探索性分析。對GEO中GSE77509數據集轉錄組數據分析發現,在差異上調的基因中發現免疫反應、先天性免疫反應、炎癥反應等多條重要的免疫和炎癥相關通路顯著上調,并發現ARHGAP18與PDL1水平呈正相關,提示ARHGAP18可能與腫瘤微環境中免疫抑制作用相關。

DNA甲基化異常改變是癌癥的一個特征性的表現。多項研究報道了HBV-HCC組織異常的DNA甲基化[20]。我們使用ChAMP包對ARHGAP18高/低水平組進行甲基化位點差異分析,進一步將全基因組轉錄組數據與甲基化數據進行綜合分析,結果共有32個基因在ARHGAP18高水平組和低水平組之間表現出明顯的表觀遺傳和表達模式改變,并且發現高表達/啟動子低甲基化基因包括TGFBI和CD40等免疫和炎癥明星因子,提示在ARHGAP18高水平組存在免疫和炎癥相關通路的異常激活。