基于網絡藥理學探討赤芍治療肺動脈高壓的活性成分及作用機制

潘艷　趙小芳　成秀梅

【摘要】? 目的? ? 采用網絡藥理學研究赤芍治療肺動脈高壓的潛在作用靶點及信號通路。方法? ? 檢索TCMSP數據庫得到赤芍的有效成分及作用靶點，肺動脈高壓相關疾病靶點主要通過檢索TTD、GeneCards和OMIM等數據庫獲得。通過繪制韋恩圖獲取赤芍和肺動脈高壓的交集靶點，交集靶點蛋白相互作用網絡（PPI）利用STRING數據庫構建。利用DAVID數據庫在線工具對赤芍和肺動脈高壓的交集靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析。結果? ? 獲得赤芍有效活性成分共29個，包括鞣花酸、芍藥苷、黃芩素和黃芩苷等，通過PPI圖得到IL-6、AKT1、TNF、TP53、VEGFA等關鍵蛋白。富集分析顯示，參與的通路主要集中在HIF-1信號通路、Toll-受體信號通路、NF-kB 信號通路、和TNF信號通路等。結論? ? 赤芍治療肺動脈高壓可能通過調節IL-6、AKT1、TNF、VEGFA和MMP9等關鍵蛋白，干預HIF-1信號通路、Toll-受體信號通路、NF-kB 信號通路和TNF 信號通路等來發揮作用，確切機制仍需要進一步的實驗驗證。

【關鍵詞】? 赤芍； 肺動脈高壓； 網絡藥理學； 成分-靶標-通路

Prediction of active ingredient and mechanism of radix paeoniae rubra in treatment of pulmonary hypertension based on network pharmacology

Pan Yan，Zhao Xiaofang，Cheng Xiumei. The Jiangsu Vocational College of Medicine，Yancheng，Jiangsu? ?224005

【Abstract】? Objective? ? To explore the potential targets and signal pathway of Radix Paeoniae Rubra in treating pulmonary hypertension with network pharmacology.Methods? ? Tcmsp was used to retrieve the active ingredients of Radix Paeoniae Rubra and their potential targets.The related targets of PH were collected by TTD，GeneCards，and OMIM）The intersection targets of Radix Paeoniae Rubra and pulmonary hypertension were determined by the Wayne diagram.The protein-protein interaction（PPT）network of the intersection targets was constructed by using the STRING database.The enrichment analysis of GO function and KEGG pathway was analyzed by the DAVID database.Results? ? A total of 29 active ingredients were obtained.The PPI network showed some core targets including IL-6，AKT1，TNF，TP53，VEGFA，etc.The enrichment analysis indicated that the differentially expressed genes were mainly enriched in HIF-1 signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，NF-kappa B signaling pathway，TNF signaling pathway and so on.Conclusion? ? Radix Paeoniae Rubra was predicted to exert therapeutic effect through multi-component，multi-target and multi-pathway.

【Key Words】? Red peony root； Pulmonary hypertension； Network pharmacology； Ingredient-target-pathway

中圖分類號：R285? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1672-1721（2023）19-0001-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.19.001

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是各種因素導致肺動脈壓力異常升高的病理狀態，最終可發展為右心衰竭、甚至死亡，發病率和致死率較高[1]。在相當長的時間內，臨床上無治療肺動脈高壓的特效藥。目前，一些靶向藥物，如內皮素受體拮抗劑、5-型磷酸二酯酶抑制劑顯現出一定的治療效果，但對疾病進展抑制作用不確切，對死亡率的降低效果不明顯[2]。中藥具有多成分、多靶點協同作用的特點，在治療肺動脈高壓上擁有豐富的用藥經驗[3]。赤芍是茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora）或川赤芍（P.veitchii）的干燥根，具有活血化瘀功效[4]。已有研究觀察到，赤芍具有治療肺動脈高壓的作用，但是其抗肺動脈高壓的有效成分及作用機制仍需要進一步明確[5]。本文采用網絡藥理學方法篩選赤芍的有效成分，探討其治療肺動脈高壓的潛在作用機制。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 赤芍有效成分篩選及靶點預測? ? 赤芍的有效成分通過檢索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）獲得，有效成分的靶標是根據“藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似度（drug similarity，DL）≥0.18”的條件篩選出來。

1.2? ? PH疾病靶點的收集? ? 以“pulmonary hypertension”為檢索詞，通過檢索TTD、GeneCards、OMIM數據庫，收集疾病相關靶點。

1.3? ? 赤芍與PH疾病共同靶點的獲取? ? 利用生信數據分析平臺（http：//www.Bioinformatics.com.cn），通過Venn圖獲取赤芍相關靶點和PH疾病靶點的交集，即兩者的共同靶點。

1.4? ? 蛋白相互作用（PPI）網絡構建? ? 將赤芍和PH疾病交集靶點輸入STRING數據庫檢索框中，選擇物種為“homo sapines”，設置隱藏游離點，minimum required interaction score>0.4，其他參數均為默認選項，構建赤芍和PH疾病交集靶蛋白相互作用網絡（PPI），并下載該TSV文件。利用Cytoscape 3.7.1軟件載入TSV文件并進行可視化處理，再利用Network Analyzer功能，根據節點degree值篩選出排名靠前的靶點。

1.5? ? GO及KEGG富集分析? ? 赤芍和PH疾病共同靶點的GO功能和KEGG通路富集分析通過DAVID數據庫實現，并利用生信數據分析平臺進行可視化處理。

2? ? 結果

2.1? ? 赤芍有效成分篩選? ? 通過TCMSP數據庫檢索赤芍有效成分及作用靶點。獲得赤芍活性成分共29個，包括鞣花酸、芍藥苷、黃芩素和黃芩苷等化合物。再根據活性成分預測靶標共128個，剔除重復靶標，共得82個靶標，利用Uiprot數據庫，設置檢索條件為“review”“human”，將收集的靶蛋白名稱轉換為對應基因名簡稱。

2.2? ? 赤芍和PH疾病交集靶點篩選? ? 利用TTD數據庫獲得肺動脈高壓靶點18個，再采用GeneCards數據庫得到肺動脈高壓靶點5 843個，經過2次中位數篩選后獲得最終靶點1 461個。利用OMIM數據庫得到肺動脈高壓靶點244個，剔除重復靶點，將3個數據庫收集的靶點取并集共得1 651個肺動脈高壓靶點，與赤芍的82個靶點通過Venn圖取交集，獲得的46個赤芍-肺動脈高壓交集靶點，即為赤芍治療肺動脈高壓潛在靶點，見圖1。

2.3? ? PPI網絡構建及核心靶點篩選? ? 通過STRING數據庫將赤芍-肺動脈高壓46個交集靶點繪制PPI網絡，利用 Cytoscape 3.6.1軟件進行可視化處理，見圖2。根據相互作用節點degree數值大小進行核心靶點篩選。篩選出白介-6（IL-6）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、腫瘤蛋白p53（TP53）、血管內皮生長因子A（VEGFA）和基質金屬蛋白酶9（MMP9）等蛋白。

2.4? ? GO及KEGG富集分析? ? 赤芍-肺動脈高壓共同靶點的GO富集分析是利用DAVID在線工具實現的，共獲得生物過程（biological process，BP）條目227個（P<0.05），主要涉及對低氧的反應、凋亡的正負調控和MAPK級聯反應的調控等；細胞組成（cellular component，CC）條目26個（P<0.05），主要涉及線粒體、質膜、細胞質和核質等；分子功能（molecular function，MF）條目47個（P<0.05），主要涉及酶激活、蛋白酶激活和蛋白激酶激活等，見圖3。同時，利用DAVID在線工具對赤芍-肺動脈高壓共同靶點進行KEGG通路富集分析，主要涉及HIF-1信號通路、Toll-受體信號通路、NF-kB 信號通路、和TNF信號通路等，見圖4。

3? ? 討論

赤芍是茛科植物芍藥或川赤芍的干燥根，具有清熱涼血，散瘀止痛的療效[4]。但是，關于赤芍治療肺動脈高壓的具體分子機制仍不清楚，其部分原因在于赤芍成分復雜，作用靶點較多[4]。本文利用網絡藥理學首次系統全面地預測赤芍治療肺動脈高壓的機制，為赤芍防治肺動脈高壓、肺心病提供分子理論基礎。

本研究通過TCMSP數據庫分析發現，赤芍的主要活性成分包括鞣花酸、芍藥苷、黃芩素和黃芩苷等化合物。李海燕通過大鼠缺氧性肺動脈高壓實驗發現，鞣花酸對肺動脈平滑肌細胞的異常增生有抑制作用，同時可降低右心室壓力，改善右心肥厚程度[6]。錢國清等人研究發現，芍藥苷可誘導低氧大鼠肺動脈平滑肌細胞凋亡，其作用機制主要包括阻滯細胞周期、調節Bcl-2和Bax蛋白表達[7]。而魏澤卉通過野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓模型發現，黃芩素可能通過抑制MAPK和NF-κB信號通路來抑制肺血管重構，從而改善肺動脈高壓和右心室肥厚[8]。

本研究通過PPI網絡分析發現，IL-6、AKT1、TNF、TP53、VEGFA和MMP9等蛋白節點度值較高，推測這些蛋白可能是赤芍治療肺動脈高壓的重要靶點。一些隊列研究顯示，血清中IL-6在肺動脈高壓組較對照組高，與肺動脈高壓特定臨床亞型預后相關，提示IL-6是治療肺動脈高壓的潛在靶點[9]。Tang H等人利用Akt1敲除小鼠研究發現，Akt1可能在肺動脈高壓發病上起著關鍵性作用，是治療肺動脈高壓潛在靶點[10]。臨床上觀察到，TNF-α在肺動脈高壓患者中表達水平較高，Fujita M等人利用TNF-α轉基因小鼠研究發現，過表達TNF-α導致嚴重的肺動脈高壓[11]。而George J等人研究發現，MMP-9在肺動脈高壓的發病機制中起著重要作用，有效阻斷MMP-9可為人類肺動脈高壓的治療干預提供一種選擇[12]。

本研究通過富集分析發現，預測的靶基因主要集中在 HIF-1信號通、Toll-受體信號通路、NF-kB信號通路和TNF信號通路等。Lei W等人研究發現，HIF-1α基因和蛋白表達在肺動脈高壓患者中較正常對照組高[13]。而Smith K A等人利用動物模型發現，HIF-1α在低氧誘導的右心室重塑、右心室肥厚發揮著重要作用[14]。同樣，Toll-受體信號通路在肺動脈高壓中扮演重要角色，Farkas D等人研究表明，降低Toll-受體3表達，可以促進血管內皮細胞凋亡和肺血管重塑[15]。

綜上所述，本文通過網絡藥理學系統全面預測赤芍治療肺動脈高壓的作用機制，發現其可能通過調節IL-6、AKT1、TNF、VEGFA、MMP9等關鍵蛋白，干預HIF-1信號通路、Toll-受體信號通路、NF-kB信號通路和TNF 信號通路等來發揮作用。本文仍存在一定的局限性，相關結論是通過在線工具預測，仍需要實驗進一步驗證。

參考文獻

[1]? ? POCH D，MANDEL J.Pulmonary Hypertension[J].Ann Intern Med，2021，174（4）：C49-C64.

[2]? ? CONDON D F，AGARWAL S，CHAKRABORTY A，et al.Novel Mechanisms Targeted by Drug Trials in Pulmonary Arterial Hypertension[J].Chest，2022，161（4）：1060-1072.

[3]? ? 尹連紅，楊悅悅，鄭玲俐.肺動脈高壓發病機制及中藥干預研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報，2022，24（1）：213-220.

[4]? ? 吳玲芳，王子墨，赫柯芊，等.赤芍的化學成分和藥理作用研究概況[J].中國實驗方劑學雜志，2021，27（18）：198-206.

[5]? ? 賈雁賓，湯泰秦.赤芍注射液治療慢性肺心病、肺動脈高壓的臨床研究[J].中西醫結合雜志，1991（4）：199-202.

[6]? ? 李海燕.鞣花酸對缺氧肺動脈高壓影響的研究[D].廣西醫科大學，2019.

[7]? ? 錢國清，褚金國，李國祥，等.芍藥苷對低氧大鼠肺動脈平滑肌細胞凋亡的影響[J].中華中醫藥學刊，2013，31（12）：2709-2710.

[8]? ? 魏澤卉.黃芩素通過抑制血管重構改善野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓[D].山西醫科大學，2017.

[9]? ? SIMPSON C E，CHEN J Y，DAMICO R L，et al.Cellular sources of interleukin-6 and associations with clinical phenotypes and outcomes in pulmonary arterial hypertension[J].Eur Respir J， 2020，55（4）：1901761.

[10]? ? TANG H，CHEN J，FRAIDENBURG D R，et al.Deficiency of Akt1，but not Akt2，attenuates the development of pulmonary hypertension[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2015，308（2）：L208-L220.

[11]? ? FUJITA M，SHANNON J M，IRVIN C G，et al.Overexpression of tumor necrosis factor-alpha produces an increase in lung volumes and pulmonary hypertension[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，280（1）：L39-L49.

[12]? ? GEORGE J，D'ARMIENTO J.Transgenic expression of human matrix metalloproteinase-9 augments monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension in mice[J].J Hypertens，2011，29（2）：299-308.

[13]? ? LEI W，HE Y，SHUI X，et al.Expression and analyses of the HIF-1 pathway in the lungs of humans with pulmonary arterial hypertension[J].Mol Med Rep，2016，14（5）：4383-4390.

[14]? ?SMITH K A，WAYPA G B，DUDLEY V J，et al.Role of Hypoxia-Inducible Factors in Regulating Right Ventricular Function and Remodeling during Chronic Hypoxia-induced Pulmonary Hypertension[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2020，63（5）：652-664.

[15]? ? FRAKAS D，THOMPSON A，BHAGWANI A R，et al.Toll-like Receptor 3 Is a Therapeutic Target for Pulmonary Hypertension[J].Am J Respir Crit Care Med，2019，199（2）：199-210.

（收稿日期：2023-04-16）