化橘紅（柚）飲片、標準湯劑和配方顆粒相關性研究*

黃凱偉，任應宗△，張 輝，譚 沛，張麗君，鄭曉英，趙偉志

（1. 華潤三九醫藥股份有限公司，廣東 深圳 518110； 2. 華潤三九現代中藥制藥有限公司，廣東 惠州 516000）

化橘紅（柚）來源于蕓香科植物柚Citrus grandis（L.）Osbeck 未成熟或近成熟的干燥外層果皮，具有散寒、燥濕、利氣、消痰的功效，用于治療風寒咳嗽、喉癢痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶等［1］，主要含有黃酮類、香豆素類、揮發油、多糖等成分［2］。現代藥理學研究表明，化橘紅具有抗炎、抗氧化、免疫調節、防治糖尿病患者心肌功能損傷等作用，具有較好的臨床應用價值［3］。中藥配方顆粒是在中醫藥理論指導下由單味中藥飲片經水提取、固液分離、濃縮、干燥、制粒而制得的顆粒，按照中醫臨床處方調配，供患者沖服的制劑［4］。國家藥典委員會2021 年發布的《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》（以下簡稱《要求》）提出，中藥配方顆粒標準研究中應對藥材、飲片、標準湯劑、中間體提取物和成品配方顆粒的特征圖譜或指紋圖譜進行相關性研究［5-7］，以保證其顆粒的質量符合傳統湯劑的要求。目前，有關化橘紅（柚）藥材的化學成分測定和特征圖譜研究較多，且方法多集中于超高效液相（UPLC）法［8-10］，尚無對化橘紅（柚）及其制劑產品特征圖譜相關性研究的報道。為此，本研究中建立了化橘紅（柚）飲片、標準湯劑、配方顆粒的UPLC 指紋圖譜，對其相關性進行評價，探討化橘紅（柚）配方顆粒制備過程中化學成分間的差異，確保顆粒劑與湯劑質量的一致性，旨在為化橘紅（柚）配方顆粒的質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters H-Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Agilent Q - TOF 6545 LC/ MS 型高分辨串聯質譜（美國Agilent 公司）；XSE205 型分析天平（精度為萬分之一），ME36S 型分析天平（精度為百萬分之一），均購于瑞士Mettler Toledo 公司；SK5200H 型數控超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司，功率為800 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

柚皮苷對照品（批號為110722 - 201815，含量為91.7%），野漆樹苷對照品（批號為111919-201804，含量為95.5%），化橘紅（柚）對照藥材（批號為121165 -201804），均購于中國食品藥品檢定研究院；維采寧-2對照品（佛山奧羽生物科技有限公司，批號為AY230001-202208，含量為98.0%）；橙皮內酯水合物對照品（上海詩丹德標準技術服務有限公司，批號為ST58400205，含量為95.0%）；甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純；15 批化橘紅（柚）藥材經安徽中醫藥大學劉守金教授鑒定均為正品，藥材飲片樣品信息見表1。

表1 15批藥材、飲片、標準湯劑、配方顆粒樣品信息Tab.1 Information of 15 batches of Citri Grandis Exocarpium and its decoction slices，standard decoction and dispensing granules

2 方法與結果

2.1 試驗條件

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：CORTECSUPLC?T3柱（100 mm×2.1 mm，16μm）；流動相：甲醇（A）-2%乙酸溶液（B），梯度洗脫（程序見表2）；流速：0.2 mL/ min；柱溫：35 ℃；檢測波長：315 nm。理論板數按柚皮苷峰計應不低于5 000。

表2 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.2 Gradient elution procedure of mobile phase（%）

2.1.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子（ESI）；掃描方式：正負離子模式；掃描范圍：全質量掃描，質荷比（m/z）50～1 700；鞘氣溫度：350 ℃；干燥氣溫度：320 ℃；干燥氣流速：8 L/min；霧化氣壓力：35 psi；鞘氣流速：11 L/min；毛細管電壓：4 000 V；噴嘴電壓：1 000 V，；解電壓：175 V；錐孔電壓：60 V；碰撞能量（CE）：40 eV。

2.2 樣品制備

15 批化橘紅（柚）飲片（編號為YP1 - YP15）嚴格按2020 年版《中國藥典（一部）》化橘紅（柚）項下飲片炮制規定進行炮制［1］。15 批化橘紅（柚）飲片標準湯劑（編號為BT1 - BT15）嚴格按《醫療機構中藥煎藥室管理規范》［11］、《要求》［6］中煎藥方法進行制備，取化橘紅（柚）飲片，提取制得標準湯劑，根據《要求》進行低溫減壓濃縮，冷凍干燥，得化橘紅（柚）飲片標準湯劑凍干粉。15 批化橘紅（柚）配方顆粒（編號為PFKL1 -PPFKL15）由水提取，加麥芽糊精輔料，經濃縮、干燥、制粒等步驟得到。

2.3 溶液制備

取柚皮苷對照品和野漆樹苷對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含0.6 mg、25μg的混合對照品溶液。

取飲片樣品粉末（過4 號篩）0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水50 mL，加熱回流45 min，放冷，搖勻，濾過，蒸干，加50%甲醇50 mL，密塞，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，即得飲片供試品溶液。取標準湯劑和配方顆粒樣品各0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇50 mL，密塞，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，即得標準湯劑和配方顆粒供試品溶液。

取麥芽糊精輔料，按配方顆粒制備方法制備陰性顆粒樣品；取樣品0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇50 mL，密塞，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，即得陰性顆粒對照品溶液。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取2.3項下配方顆粒供試品溶液、陰性顆粒對照品溶液各1μL，按2.1 項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖。結果表明，陰性樣品無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 超高效液相色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms

精密度試驗：取配方顆粒樣品（批號為PFKL3），按2.3 項下方法制備配方顆粒供試品溶液，按2.1 項下試驗條件連續進樣測定6 次，以5 號峰柚皮苷為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于2%（n=6），表明儀器精密度良好。

中間精密度試驗：取精密度試驗項下配方顆粒供試品溶液2 份，分別由2 名檢驗員在不同時間用同一臺設備，按2.1 項下試驗條件進樣測定，以5 號峰柚皮苷為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%，表明方法中間精密度良好。

穩定性試驗：取精密度試驗項下配方顆粒供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，18，24，36，48 h時按2.1 項下試驗條件進樣測定，以5 號峰柚皮苷為參照峰，計算得各共有峰的相對保留時間的RSD均小于2%（n=9），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取配方顆粒樣品（編號為PFKL3）6份，依法制備配方顆粒供試品溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，以5號峰柚皮苷為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明方法重復性良好。

2.5 UPLC 指紋圖譜建立與相似度評價

指紋圖譜建立：分別取15批化橘紅（柚）飲片、標準湯劑和配方顆粒，按2.3項下方法分別制備供試品溶液，按2.1項下試驗條件進樣測定，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）對色譜圖進行匹配，確定化橘紅（柚）飲片、標準湯劑、配方顆粒均有9 個共有峰（圖2 至圖3）。根據樣品多級質譜信息，結合天然產物高分辨質譜數據庫及相關文獻，對9個目標峰進行鑒定，明確了峰2至峰9的相對分子質量、分子式和化學成分（表3），并通過與對照品圖譜比對，確定了4號峰、5號峰、6號峰、7號峰的保留時間分別與維采寧-2、柚皮苷、野漆樹苷、橙皮內酯水合物的保留時間相對應。

圖3 超高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.3 UPLC reference fingerprints

表3 共有峰化學成分鑒定結果Tab.3 Identification results of chemical components of common peaks

相似度評價：分別將15 批化橘紅（柚）飲片、標準湯劑、配方顆粒UPLC 指紋圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版），分別計算各批次化橘紅（柚）飲片、標準湯劑、配方顆粒UPLC 指紋圖譜與其對照圖譜的相似度，結果見表4。可見，15 批化橘紅（柚）飲片、標準湯劑、配方顆粒UPLC 指紋圖譜與其相應對照指紋圖譜的相似度均大于0.900，表明不同批次化橘紅（柚）飲片、標準湯劑、配方顆粒的質量較穩定。

表4 15批飲片、標準湯劑和配方顆粒指紋圖譜相似度評價結果Tab.4 The fingerprint similarity results of 15 batches of decoction pieces，standard decoction and dispensing granules

2.6 化學模式識別研究

共有峰相關性分析：特征選擇通過衡量特征與類別的相關性，剔除不相關特征和冗余特征，有助于提高分類準確率。采用SPSS 26.0 統計學軟件，以15 批化橘紅（柚）飲片、標準湯劑和配方顆粒共45 個樣品各共有峰的峰面積占比，即各共有峰峰面積占共有峰總面積的比例為變量進行皮爾遜相關性分析。結果見表5。可見，化橘紅（柚）飲片與標準湯劑比較，峰3、峰7、峰9 具有顯著相關性（P＜0.05），其他共有峰相關性不顯著；化橘紅（柚）標準湯劑與配方顆粒比較，9 個峰均具有極顯著正相關性（P＜0.01）。

表5 15批飲片、標準湯劑、配方顆粒指紋圖譜共有峰的相關性分析結果Tab.5 Correation anlasis results of common peaks of decoction pieces，standard decoction and dispensing granules

聚類分析：采用SPSS 26.0 統計學軟件，以15 批化橘紅（柚）飲片、標準湯劑和配方顆粒45 個樣品共有峰峰面積為變量進行聚類分析，結果見圖4。可見，當距離為25 時，45 個樣品可聚為兩大類。其中，編號為YP1、YP2、YP7、YP8、YP9、YP10、YP13、YP14、YP15的樣品聚為一類；化橘紅（柚）標準湯劑與配方顆粒之間無明顯差異，可聚為一類。

圖4 15批飲片、標準湯劑和配方顆粒特征圖譜層次聚類分析圖Fig.4 Dendrogram of hierarchical cluster analysis for 15 batches of decoction pieces，standard decoction and dispensing granules

主成分分析：采用SPSS 26.0 統計學軟件，對15 批化橘紅（柚）飲片、標準湯劑和配方顆粒共45 個樣品各共有峰峰面積的標準化值（Zi）進行主成分分析，主成分結果以特征值＞1為標準提取得到3個主成分，計算得特征值與方差貢獻率（表6）、主成分因子載荷矩陣（表7）。可見，前3 個主成分因子累計方差貢獻率為82.863%，說明這3 個主成分能預測化橘紅（柚）指紋圖譜特征峰指標的主要信息。主成分1的特征值為3.823，方差貢獻率為42.478%，載荷較高的峰有峰1、峰2、峰4（維采寧-2）、峰5（柚皮苷）、峰6（野漆樹苷），表明這5 個峰主要反映主成分1 的信息；主成分2 的特征值為2.439，方差貢獻率為27.101%，載荷較高的峰有峰3、峰7（橙皮內酯水合物）、峰8，表明這3 個峰主要反映主成分2 的信息；主成分3 的特征值為1.196，方差貢獻率為13.284%，載荷較高的峰有峰9，表明該峰主要反映主成分3 的信息。

表6 15批飲片、標準湯劑和配方顆粒主成分分析特征值與方差貢獻率Tab.6 Characteristic value and variance contribution rate of 15 batches of decoction pieces，standard decoction and dispensing granules

表7 15批飲片、標準湯劑和配方顆粒主成分因子載荷矩陣Tab.7 Factors loading matrix of 15 batches of decoction pieces，standard decoction and dispensing granules

正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）：以15批化橘紅（柚）飲片、標準湯劑和配方顆粒共45 個樣品各共有峰峰面積為變量，采用OPLS-DA模式識別方法進行樣品特征圖譜差異性分析，獲得組間成分差異貢獻率較大的共有峰。采用SIMCA 14.1 軟件進行OPLS - DA模型擬合，結果45 個樣品分為3 類。以變量重要性投影值（VIP）大于1.0 為標準篩選差異特征峰，分別為峰5（柚皮苷）、峰6（野漆樹苷）和峰7（橙皮內酯水合物），說明這3個共有峰對應成分是影響飲片、標準湯劑和配方顆粒質量的差異性成分。詳見圖5和圖6。

圖5 OPLS-DA分析的Score得分圖Fig.5 The Score plot of OPLS - DA analysis

圖6 OPLS-DA模型中各共有特征峰的VIP值Fig.6 VIP values of common charasteristic peaks in OPLS-DA model

3 討論

按照《要求》，中藥配方顆粒應對藥材、飲片、標準湯劑、中間體提取物和成品配方顆粒的特征圖譜或指紋圖譜相關性進行研究。中藥指紋圖譜是一種綜合、全面的評價技術，可全面反映中藥化橘紅（柚）所含化學成分的種類與質量水平。故本研究中通過建立化橘紅（柚）飲片、標準湯劑、配方顆粒的UPLC 指紋圖譜，對三者的相關性進行評價。共確定9 個共有峰，并指認了其中4 個共有峰，即峰4 為維采寧-2、峰5 為柚皮苷、峰6為野漆樹苷、峰7 為橙皮內酯水合物。相似度評價結果顯示，15 批化橘紅（柚）飲片、標準湯劑和配方顆粒均與相應的對照指紋圖譜的相似度較高（＞0.900），表明不同批次的化橘紅（柚）整體的化學成分具有較好的一致性。化學模式識別研究結果顯示，不同批次化橘紅（柚）飲片較分散，主要由產地不同、特征成分的含量積累不同造成的；不同批次標準湯劑、配方顆粒之間較緊密，表明配方顆粒生產制備過程中，各特征峰均能穩定性傳遞，沒有發生明顯降解或增加，制得的配方顆粒的質量與傳統標準湯劑基本一致。飲片與標準湯劑、配方顆粒之間的差異較大，可能是由于供試品制備方法差異導致了各特征峰的化學成分含量的差異。但從特征峰的個數上分析，表明飲片與標準湯劑、配方顆粒在化學成分的一致性。

OPLS - DA 將45 個樣品分為3 類，并篩選出3 個VIP 大于1的差異性成分，分別為峰5（柚皮苷）、峰6（野漆樹苷）和峰7（橙皮內酯水合物）。因此，計劃下一步從這3 個特征性成分出發，進一步評價化橘紅（柚）飲片、標準湯劑和配方顆粒含量的相關性。

綜上所述，本研究中建立的方法專屬性強、重復性好，可用于化橘紅（柚）飲片、標準湯劑和配方顆粒的指紋圖譜分析。化橘紅（柚）飲片、標準湯劑和配方顆粒相關性較好，可有效控制化橘紅（柚）配方顆粒生產制備過程中從原料到成品階段的質量。