涼解感冒合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

陳 芳，樊寶娟△，呼延婷婷.2，黃 艷，王夢(mèng)琪，羅定強(qiáng)

（1. 陜西省食品藥品檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710065； 2. 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品微生物檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710065）

涼解感冒合劑由大青葉、牛蒡子、紫荊皮、荊芥等藥材組方，用于治療風(fēng)熱感冒引起的發(fā)熱、惡風(fēng)、頭痛、鼻塞流涕、咳嗽、咽喉腫痛等癥，具有解表、清熱、宣肺、利咽等功效。方中，馬勃善清肺熱，與桔梗合用有開(kāi)宣肺氣、清利咽喉、止咳祛痰之效；薄荷疏散風(fēng)熱，解毒透疹，清利頭目；牛蒡子宣肺發(fā)疹，清咽利喉；大青葉清熱解表，涼血解毒；紫荊皮清熱解毒，利濕；荊芥辛溫，開(kāi)泄腠理，疏散邪氣。全方藥味組成較復(fù)雜，涉及辛涼解表、清熱解毒、清利咽喉、宣暢肺氣等，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)很難用單一指標(biāo)體現(xiàn)［1］。為了全面、有效地控制制劑質(zhì)量，本研究中對(duì)方中的桔梗、馬勃藥材進(jìn)行了薄層色譜（TLC）鑒別，并采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定君藥大青葉中腺苷的含量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Alliance HT 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；UV-2550 型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；Sartorius BS224S 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，精度為萬(wàn)分之一）；AE - 240 型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為十萬(wàn)分之一）；KQ - 500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；F2 型恒溫水浴箱（北京化玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 試藥

桔梗對(duì)照藥材（批號(hào)為121028 - 201411），馬勃對(duì)照藥材（批號(hào)為121417-201302），腺苷對(duì)照品（批號(hào)為110879 - 200202，純度為99.7%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；涼解感冒合劑（陜西白鹿制藥股份有限公司，規(guī)格為每支10 mL，批號(hào)分別為150504，150505，150507，150508，150903，150905，150906，151206，151207，151210）；硅膠G（青島海洋化工廠）；乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)天地公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純（西安化學(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

桔梗［2-5］：取樣品10 mL，加7%硫酸乙醇-水溶液（1∶1，V/V）20 mL，加熱回流3 h，放至室溫，用三氯甲烷提取2 次，每次20 mL，合并提取液，用水洗滌2 次，每次30 mL，棄去洗液，提取液用無(wú)水硫酸鈉脫水，濾過(guò)，濾液回收溶劑至干，殘?jiān)? mL甲醇使溶解，即得供試品溶液。對(duì)照藥材按處方工藝進(jìn)行前處理，加水30 mL，加熱回流30 min，取濾液，同法制備桔梗對(duì)照藥材溶液。按處方比例和工藝制備不含桔梗的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC 法［6］試驗(yàn)，吸取對(duì)照藥材溶液5μL、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板，以三氯甲烷- 乙醚（2∶1，V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液顯色，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯色完全一致，特征斑點(diǎn)清晰，分離良好，無(wú)拖尾，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 A。

圖1 薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatograms

馬勃［7-10］：取樣品10 mL，60 ℃水浴蒸至近干，加二氯甲烷30 mL，加熱回流60 min，濾過(guò)，濾液蒸干，加甲醇1 mL使溶解，即得供試品溶液。取馬勃對(duì)照藥材1 g，加水20 mL，加熱回流30 min，濾過(guò)，濾液同法制備，即得對(duì)照藥材溶液。取按處方比例和工藝制備不含馬勃的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC 法［6］試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各20μL、對(duì)照藥材溶液5μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以環(huán)己烷-丙酮-乙醚（10∶1∶2，V/V/V）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，特征斑點(diǎn)清晰，分離良好，無(wú)拖尾，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 B。

2.2 HPLC 法測(cè)定腺苷含量［11-12］

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent-5TC-C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（5∶4∶91，V/V/V）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 溶液制備

取腺苷對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成質(zhì)量濃度為9.472 0μg/mL的對(duì)照品溶液。精密量取樣品10 mL，置具塞錐形瓶中，水浴蒸干，冷卻至室溫，精密加入30%甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，密塞，超聲處理（功率為500 W，頻率為40 kHz）30 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用30%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。根據(jù)處方工藝制備缺大青葉的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10μL，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處有相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明方法專屬性良好。詳見(jiàn)圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液2，5，10，15，20，25 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=3 016.8X-11 350，r=1.000 0（n=6）。結(jié)果表明，腺苷進(jìn)樣量在18.944 0～236.800 0 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取2.2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果腺苷峰面積的RSD為0.39%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于0，4，8，12，16，20，24 h時(shí)按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果腺苷峰面積的RSD為1.26%（n= 7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取同一批（批號(hào)為150505）樣品6 份，各10 mL，按2.2.2 項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算腺苷含量。結(jié)果腺苷含量的RSD為2.05%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：分別取樣品（每支含腺苷0.496 0 mg）6 份，各5 mL，分別加入1 mL 腺苷對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.261 6 mg/ mL），低溫蒸干，冷卻至室溫，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.4 樣品含量測(cè)定

分別精密量取10 批樣品各10 mL，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算腺苷含量。結(jié)果10 批樣品中每支分別含腺苷0.61，0.58，0.57，0.58，0.57，0.54，0.52，0.50，0.50，0.58 mg，平均每支含腺苷0.56 mg。

3 討論

3.1 TLC 鑒別藥材選擇

分別從提取溶劑、提取方法、吸附劑、顯色方法等對(duì)大青葉、紫荊皮進(jìn)行了考察［13-17］，結(jié)果大青葉供試品溶液色譜與對(duì)照品溶液及對(duì)照藥材溶液色譜在相應(yīng)位置均未顯相同顏色的斑點(diǎn)，或顯相同顏色的斑點(diǎn)、但斑點(diǎn)分離度不好；紫荊皮供試品溶液色譜與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置均未顯相同顏色的斑點(diǎn)。故大青葉、紫荊皮TLC 鑒別有待進(jìn)一步研究，暫未被列入涼解感冒合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。最終僅對(duì)桔梗和馬勃作TLC鑒別。

3.2 含量測(cè)定指標(biāo)成分選擇

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大青葉具有抗病毒［18］、抗內(nèi)毒素［19］、抑菌［20］等作用，常用于上呼吸道感染、流行性乙型腦炎、麻疹肺炎、咽喉炎、扁桃體炎等的治療［21］，主要成分有腺苷、靛玉紅、靛藍(lán)和氧化苦參堿［20，22］。腺苷是一種內(nèi)源性核苷，遍布于人體的細(xì)胞中，是重要的核苷類抗病毒藥物，具有多種生物學(xué)活性，可用于治療多種病毒性疾病，主要破壞病毒轉(zhuǎn)錄過(guò)程，通過(guò)選擇性抑制病毒的聚合酶而阻止病毒復(fù)制，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒作用［23-24］。有研究報(bào)道，靛藍(lán)、靛玉紅不具備抗毒素活性［25］，且樣品中大青葉經(jīng)水提工藝提取，而靛玉紅、靛藍(lán)均為脂溶性成分，故選擇腺苷作為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

3.3 樣品提取方法考察

預(yù)試驗(yàn)中，對(duì)加熱回流提取法和超聲提取法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)超聲提取所得腺苷含量明顯高于同條件下加熱回流提取所得含量，故選擇超聲提取法。分別考察以水、甲醇和30%甲醇溶液為提取溶液進(jìn)行超聲提取的效果，發(fā)現(xiàn)30%甲醇溶液提取效率最高，故選擇30%甲醇溶液作為提取溶劑；考察了超聲處理20，30，40 min 的提取效果，發(fā)現(xiàn)超聲提取20 min 時(shí)含量最低，30 min和40 min所得腺苷含量基本一致，考慮到時(shí)間成本，故選擇超聲提取30 min；考察了溶液量為25，50，100 mL 30%甲醇溶液的提取效果，發(fā)現(xiàn)50 mL和100 mL所得腺苷含量相當(dāng)。故選擇50 mL 30%甲醇溶液進(jìn)行提取。

3.4 色譜條件考察

分別考察了Ultimate 和Agilent 2 個(gè)品牌的色譜柱，結(jié)果分離度均良好，不影響被測(cè)成分的含量，故選擇Agilent-5TC-C18（2）柱進(jìn)行試驗(yàn)。分別考察了不同柱溫（25，30，35 ℃）對(duì)被測(cè)成分含量的影響，發(fā)現(xiàn)柱溫不影響其含量，故柱溫選擇30 ℃。取質(zhì)量濃度為9.472 0μg/mL的腺苷對(duì)照品溶液，于200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果于260 nm波長(zhǎng)處有最大吸收；分別于255，260，265 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定，結(jié)果分離度均良好，不影響被測(cè)成分的含量，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇260 nm。考察了乙腈-水（6∶94，V/V）作流動(dòng)相對(duì)檢測(cè)效果的影響，結(jié)果供試品溶液色譜圖中的目標(biāo)峰未達(dá)到基線。pH 6.5的磷酸鹽緩沖液［取0.01 mol/L磷酸二氫鈉68.5 mL與0.01 mol/L磷酸氫二鈉31.5 mL，混合（pH 6.5）］- 甲醇（85∶15，V/V）所得色譜圖分離度較好，但流動(dòng)相配制復(fù)雜，且對(duì)色譜柱的損害較大。最終選擇流動(dòng)相為甲醇- 乙腈-水（5∶4∶91，V/V/V）。

3.5 含量限度擬訂

由含量測(cè)定可知，樣品中腺苷含量為每支0.50～0.61 mg，平均每支0.56 mg。又對(duì)3 批大青葉藥材中腺苷轉(zhuǎn)移率進(jìn)行了考察，平均轉(zhuǎn)移率為53.29%，鑒于該制劑中大青葉藥材為水提工藝，轉(zhuǎn)移率基本合理。建議采用腺苷含量平均值的70%作為限度。故擬訂涼解感冒合劑中每支含腺苷不少于0.40 mg。

3.6 方法評(píng)價(jià)

所建立的方法簡(jiǎn)便易行、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于涼解感冒合劑的質(zhì)量控制。