十一味定喘口服液質量控制方法研究*

任 瑩，孫志晴，李 智，王鑫瑞，李 喬

（安徽省界首市中醫院，安徽 阜陽 236600）

十一味定喘口服液為我院呼吸與危重癥科針對痰熱內蘊、風寒外束之哮喘等擬訂的方劑，清痰熱，外散風寒，宣降肺氣而平哮喘，具有宣肺降氣、清熱化痰功效。方中，黃芩性寒，味苦，主歸肺經，具有清熱燥濕、瀉火解毒功效。藥理學研究表明，黃芩苷具有顯著的抗呼吸道合胞病毒［1-2］、抗氧化［3-4］、抑菌［5-6］和抗炎活性［7］。為有效控制其質量，保證治療效果，本研究中建立了桑白皮、麻黃、甘草的薄層色譜鑒別法，并采用高效液相色譜法測定黃芩苷的含量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Alliance e2695 型高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司），配有紫外檢測器；225D-1CN 型分析天平（德國賽多利斯公司，精度為0.01 mg）；硅膠G 板（青島海洋化工廠分廠，煙臺江友硅膠開發有限公司）；ZF-2型三用紫外儀（上海金鵬分析儀器有限公司）；KQ-400E型旋鈕式超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為1 200 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

麻黃對照藥材（批號為121051 - 201606），桑白皮對照藥材（批號為121124-202109），甘草對照藥材（批號為120904-202021），黃芩苷對照品（批號為110715-202122，純度為94.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；黃芩飲片（亳州滬譙藥業有限公司，批號為2201140102）；甲醇（色譜純，美國天地有限公司）；水為超純水（實驗室自制）；磷酸（色譜純）；甲醇、碳酸鈉、鹽酸、乙酸乙酯、氨水、三氯甲烷、無水乙醇、正丁醇、冰醋酸、茚三酮、乙醚、二氯甲烷、硫酸均為分析純；十一味定喘口服液（醫院制劑，批號分別為22062301，22062401，22062501）。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

桑白皮［8-9］：取3批（批號分別為22062301，22062401，22062501）樣品各10 mL，置蒸發皿中，水浴濃縮至近干，加飽和碳酸鈉溶液20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液加稀鹽酸調pH 至1～2，靜置30 min，加乙酸乙酯振搖提取2次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，水浴揮干，以1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。按處方工藝制備缺桑白皮的陰性樣品，取10 mL，同法制備缺桑白皮的陰性對照品溶液。取桑白皮對照藥材2 g，同法制備桑白皮對照藥材溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法，取供試品溶液、陰性對照品溶液、對照藥材溶液各10 μL，點于同一硅膠G 板，用石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（6∶4，V/V）展開，105 ℃下加熱2 min顯色清晰，立即置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與桑白皮對照藥材溶液色譜相應位置顯相同斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatograms

麻黃［10］：取3 批（批號分別為22062301，22062401，22062501）樣品各10 mL，加濃氨試液10滴，以三氯甲烷萃取2次，每次加三氯甲烷15 mL，分取三氯甲烷層并合并，水浴蒸干，加無水乙醇2 mL 使溶解，即得供試品溶液。按處方工藝制備缺麻黃的陰性樣品，取10 mL，同法制備缺麻黃的陰性對照品溶液。取麻黃對照藥材1 g，加濃氨試液10滴，加三氯甲烷10 mL，水浴回流1 h，濾過，取三氯甲烷液，蒸干，加無水乙醇3 mL 使溶解，即得對照藥材溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502薄層色譜法，取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照品溶液各10 μL，點于同一硅膠G 板，用正丁醇- 冰醋酸-水（4∶1∶1，V/V/V）展開，噴以茚三酮試液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與麻黃對照藥材溶液色譜相應位置顯相同斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

甘草［11］：取3 批（批號分別為22062301，22062401，22062501）樣品各10 mL，加乙醚萃取3 次，每次10 mL，棄去乙醚液，水層用正丁醇萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，每次60 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，加甲醇3 mL 使溶解，即得供試品溶液。按處方工藝制備缺甘草的陰性樣品，取10 mL，同法制備缺甘草的陰性對照品溶液。取甘草對照藥材1 g，加乙醚40 mL，水浴回流1 h，濾過，藥渣加甲醇30 mL，水浴回流1 h，濾過，取甲醇液，蒸干，殘渣加水40 mL 使溶解，加正丁醇萃取3 次，每次20 mL，合并萃取后的正丁醇液，再用等體積（60 mL）水洗滌3次，將洗滌后的正丁醇液蒸干，加甲醇3 mL 使溶解，即得對照藥材溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法，取供試品溶液、對照藥材溶液、陰性對照品溶液各10μL，點于同一硅膠G 板，用二氯甲烷- 甲醇- 水（40∶10∶1，V/V/V）展開，噴以10%硫酸乙醇溶液，熱風吹或105 ℃加熱至斑點顯色清晰，分別于日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與甘草對照藥材溶液色譜相應位置顯相同斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖1 C1和圖1 C2。

2.2 高效液相色譜法測定黃芩苷含量

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗［12-14］

色譜柱：依利特Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（47∶53，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫30 ℃；進樣量：10μL。理論板數按黃芩苷峰計應不低于3 000。

2.2.2 溶液制備［15-18］

取黃芩苷對照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成每1 mL 含70μg 的溶液，即得對照品溶液。精密量取樣品2 mL，置100 mL 容量瓶中，加甲醇定容，混勻，濾過，即得供試品溶液。按樣品制備工藝制備缺黃芩的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺黃芩的陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取2.2.2 項下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10μL，按2.2.1項下色譜條件進樣測定。供試品溶液色譜圖中，黃芩苷峰分離度良好，陰性對照無干擾，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms

線性關系考察［19-20］：取質量濃度為0.789 mg/mL的黃芩苷對照品溶液，逐級稀釋，得質量濃度分別為0.157 8，0.078 9，0.039 45，0.019 73，0.009 865 mg/mL的系列對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件分別進樣測定，以黃芩苷的質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= 3.480 8×107X-6.573 8×104，r=0.999 8（n=5）。結果表明，黃芩苷的質量濃度在0.009 865～0.157 800 mg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取質量濃度為78.9μg/mL 的對照品溶液，按2.2.1 項下色譜條件連續進樣測定5 次，記錄峰面積，并計算含量。結果黃芩苷峰面積的RSD為0.17%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為22062301）6 份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果樣品中黃芩苷的平均含量為3.854 mg/mL，RSD為0.50%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為22062301），按2.2.2項下方法制備供試品溶液。分別于配制后0，2，4，8，12，24 h 時按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果黃芩苷峰面積的RSD為0.98%（n=6），表明供試品溶液放置24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取樣品（批號為22062301）6 份，分別精密吸取1.00 mL，置100 mL 容量瓶中，分別精密加入質量濃度為0.843 3 mg/mL的黃芩苷對照品溶液5 mL，加甲醇定容，搖勻，濾過，取濾液。按2.2.1 項下色譜條件進樣測定，并計算加樣回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 樣品含量測定及限度確定

取黃芩飲片（批號為2201140102），按2020年版《中國藥典（一部）》黃芩飲片項下方法測定黃芩苷含量為11.92%。取3 批（批號分別為22062301，22062401，22062501）樣品，按2.2.1項下色譜條件進樣測定，計算得樣品中黃芩苷含量分別為3.82，3.83，3.82 mg/mL。十一味定喘口服液中每1 mL 含黃芩飲片0.084 g，按投料的黃芩飲片計算，每1 mL 含黃芩苷10.01 mg。根據3批樣品的實測含量，計算轉移率為38.16%～38.26%，差異不大，表明工藝較穩定。2020 年版《中國藥典（一部）》規定，按干燥品計算，黃芩飲片中含黃芩苷（C21H18O11）應不低于8.0%（80 mg/ g），故成品含量不低于2.57 mg/ mL。綜合考慮，暫定黃芩苷含量不低于2.57 mg/mL。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別藥味與對照藥材選擇

十一味定喘口服液由麻黃、炒白果、蜜桑白皮、黃芩等11味中藥材組方，其中白果、苦杏仁、酸棗仁、紫蘇子、款冬花等藥味暫無合適的薄層色譜鑒別方法。桑白皮、麻黃、甘草、黃芩的薄層色譜鑒別方法的專屬性較好，故薄層色譜中僅對桑白皮、麻黃、甘草進行定性鑒別。中藥復方制劑中各藥味定性鑒別難度較高，需嘗試多種方法，消耗大量對照品和（或）對照藥材，本研究中均采用價格相對低廉且能提供更多鑒別信息的對照藥材為參照物，以降低檢驗研發的成本。

3.2 含量測定指標成分選擇

方中，麻黃疏散風寒、宣肺平喘，白果斂肺定喘，兩藥配伍，斂收結合，既能增強平喘之功，又可宣肺而不耗氣，斂肺而不留邪，共為君藥；桑白皮瀉肺平喘，黃芩清熱化痰，兩藥配伍，可消內蘊之痰熱，共為臣藥。參考2020 年版《中國藥典（一部）》，麻黃含量測定成分為鹽酸麻黃堿和偽麻黃堿，需用特殊色譜柱且損耗較快，流動相配制煩瑣，檢測成本較高，故選用操作簡便、分離效果好的薄層色譜法進行定性鑒別；2020 年版《中國藥典（一部）》中無白果的含量測定方法。故未選擇麻黃、白果進行含量測定。臣藥黃芩的有效成分黃芩苷較穩定，4 ℃密封儲存1年的峰面積變化不大，故選擇黃芩苷作為含量測定的指標成分。

3.3 色譜條件選擇

黃芩苷在甲醇中溶解度較小，故配制對照品溶液時濃度不宜過大，必要時可進行超聲處理。采用高效液相色譜法對黃芩苷進行定量時，以甲醇- 水為流動相時的色譜峰對稱度較差，換為0.1%磷酸水溶液后色譜峰峰形明顯改善。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法操作簡便、重復性好、準確度高，可用于十一味定喘口服液的質量控制。含量限度暫定為不低于2.57 mg/mL。僅以3批制劑計算轉移率，批次較少，結果有一定局限性，后期可收集更多批次的樣品，擴大檢測樣本量，制訂更合理的含量限度。