柴胡加龍骨牡蠣湯對腫瘤后抑郁模型大鼠海馬BDNF/TrkB/CREB 信號通路的影響*

周振偉，董燕玲，楊文軒，安穎奇，張朝永，徐 瑩，段 錚，劉子琳，鄭紅剛，王清賢

（河北省唐山市第五醫院，河北 唐山 063000）

抑郁癥是一種廣泛存在的精神障礙［1］，隨著社會發展、壓力增加和情感缺失，抑郁癥的發病率逐年增加，但目前缺乏療效顯著、副作用少的抗抑郁藥［2-5］。腫瘤相關性抑郁狀態是以腫瘤為基礎疾病而引發的一種癥狀或狀態，對腫瘤患者的生存質量產生直接影響。我國腫瘤患者的腫瘤相關性抑郁發病率為25.8%～58.0%，顯著高于正常人群的發病率18.37%［6-8］。中醫藥具有靶點多、副作用少的優勢，廣泛用于抑郁癥的治療［9］。經典抗抑郁藥方常出現柴胡-白芍藥對，如柴胡疏肝散、四逆散和逍遙散［10-12］。柴胡加龍骨牡蠣湯（CLM）具有安神作用，可拮抗癡呆、失眠、焦慮、緊張和遲發性性腺功能減退，是精神障礙患者的首選處方［13-15］。動物實驗表明，CLM 長期給藥后的抗抑郁作用可能存在多種作用機制［16-17］。CLM 可能通過防止前額皮質多巴胺能和5-羥色胺能傳遞的減少，使下丘腦-垂體-腎上腺系統的功能障礙正常化，緩解慢性應激誘導的抑郁樣癥狀［18］，還可上調腦源性神經營養因子（BDNF）的表達［19］。但CLM的快速抗抑郁潛力尚待挖掘。大量研究發現，外部應激導致大鼠皮層的炎性反應，進而誘導核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎性小體的形成和炎性因子如白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF - α）的釋放［20-22］。一直以來都認為炎癥是導致抑郁癥的重要原因［23］，目前尚不清楚CLM 是否可通過促進抗炎作用，進一步產生協同抗抑郁作用。本研究中通過建立腫瘤后抑郁模型探討CLM 治療抑郁癥的機制，以期為臨床治療腫瘤后抑郁提供思路。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥、細胞與動物

儀器：DY89-Ⅱ型新芝電動玻璃勻漿器（寧波新芝生物科技公司）；HC - 3018R 型中佳高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；ELX-800 型全自動酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

試藥：超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號為A001-3 - 2），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH - Px）試劑盒（批號為A005-1-2），均購自南京建成生物工程研究所有限公司；IL-1β試劑盒（批號為P6245），IL-10試劑盒（批號為P6290），TNF-α試劑盒（批號為P6231），均購自上海碧云天生物科技公司；抗BDNF 抗體（批號為ab108319），抗酪氨酸激酶受體B（TrkB）抗體（批號為ab187041），抗環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（CREB）抗體（批號為ab32515），抗磷酸化- CREB（p - CREB）抗體（批號為ab32096），辣根過氧化物酶（HRP）-山羊抗兔（批號為ab136774），均購自美國Abcam 公司。柴胡龍骨牡蠣湯配方顆粒，組方為北柴胡12 g，龍骨、牡蠣、茯苓、珍珠母各15 g，黃芩、生姜、黨參、桂枝、半夏、大黃各9 g，大棗10 g。中藥飲片購自北京康仁堂藥業有限公司，常規煎煮后，濃縮為1.6 g/ mL 藥液，4 ℃冷藏，備用。

細胞：LLC - WRC 256 細胞（批號為CCL - 38），腹水癌細胞系LLC-WRC 256 S180細胞（批號為TIB-66），均購自American Type Culture Collection。

動物：18 只健康雄性SD 大鼠（上海斯萊克實驗動物有限責任公司，鼠齡12 個月，體質量300～350 g），實驗動物使用許可證號為SYXK ＜滬＞2022-0012。在特定的無病原體（SPF）條件下，以無菌標準實驗室飼料和水自由飼養。

1.2 方法

1.2.1 建模、分組與給藥

復蘇LLC - WRC 256 細胞，從SD 大鼠腹腔注射造模。取造模7 d 生長良好的腹水型大鼠，在無菌操作下抽取腹水，用滅菌的生理鹽水稀釋，調節細胞數為6 ×107個/mL，置冰水中保存備用；將每只SD 大鼠左前肢腋窩皮下接種腹水癌細胞系LLC-WRC 256 S180 細胞懸液0.2 mL 構建腫瘤模型；接種1 周后觀察成瘤情況，形成可觸及的腫瘤硬塊及后續實驗完成后通過1%戊巴比妥鈉安樂死小鼠后解剖，對腫瘤進行驗證。腫瘤造模成功后，腫瘤大鼠均進行為期14 d 的慢性不可預知溫和刺激（CUMS）抑郁造模［24］，共接受14 d 應激，包括熱水游泳（38 ℃，3 min），冷刺激（4 ℃，3 min），禁食24 h、禁飲24 h，晝夜顛倒，潮濕鼠籠24 h，夾尾懸尾（1 min）。每天隨機安排1 種應激，刺激周期為2 周。將18 只大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、CLM 組（每10 g 體質量給藥0.1 mL），每組6 只，眼眶采血0.5 mL，隨后安樂死，取大腦海馬組織進行后續處理。

1.2.2 血清生化指標測定

取血液，4 ℃下以3 000g的速率離心15 min，取上清液，使用前儲存溫度- 80 ℃。冰上解凍血清樣本，采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒檢測血清樣本中SOD和GSH-Px的水平，嚴格按說明書操作。

1.2.3 行為學測試

曠場實驗（OFT）：采用OFT評價實驗動物在新環境下的自主行為、探究行為與緊張程度。于40 m×40 m×15 cm 開闊場地中測量大鼠自發運動活動，監測水平活動（即行進的總距離），在光照良好的透明丙烯酸籠中測試5 min。記錄大鼠在隔板附近及場地中心區內的活動軌跡，分析其在中心區域活動的距離和時間。在不同大鼠檢測間隔期間使用75%乙醇對場地進行消殺。

懸尾實驗（TST）：采用TST 評價抗抑郁藥物的藥效。將大鼠置于聽覺和視覺都被隔離的小室中，用膠帶將大鼠尾部懸掛在離地面50 cm 處，并計算6 min 測試期最后4 min內大鼠的總靜止時間。

強迫游泳實驗（FST）：采用FST 考察嚙齒類動物行為絕望和抗抑郁反應［25］。將大鼠從籠中取出，分別放入透明的玻璃容器（高度40 cm，直徑20 cm）中，充滿30 cm的水（22～23 ℃），使大鼠在水中游泳6 min［26］。當大鼠漂浮在水面時，不會進行掙扎，只需進行必要的動作來保持頭部露出水面，認為是靜止的。使用ANY - maze 6.0軟件記錄6 min測試期最后4 min的總靜止時間。

1.2.4 ELISA 法檢測炎性因子水平

大腦海馬組織勻漿處理后，根據試劑盒說明采用ELISA法檢測海馬的IL-1β，IL-10，TNF-α的表達水平。

1.2.5 免疫印跡（Western blot）法測定蛋白表達水平

海馬組織均質化后，使用BCA 蛋白檢測試劑盒測定上清液中的蛋白濃度。將等量的蛋白質（40 μg）加載到十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠上，轉移到尼龍膜上，分別與一抗于4 ℃下孵育過夜，將膜與二抗HRP-山羊抗兔一起孵育。通過化學發光檢測條帶，使用AlphaEase 6.22軟件測量條帶的光密度。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0 統計學軟件分析，GraphPad Prism 8.0 軟件制作圖片。計量資料以表示，組間比較行獨立樣本t檢驗，多組間比較行One - Way ANOVA 分析，事后檢驗行Tukey's multiple comparisons test。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對抑郁樣行為的影響

與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清抗氧化因子SOD及GSH-Px水平均顯著下降（P＜0.01）；與模型對照組比較，CLM 組大鼠血清抗氧化因子SOD 及GSH-Px 水平均顯著上升（P＜0.01）。與正常對照組比較，模型對照組大鼠OFT 距離與時間、TST 與FST 靜止時間均顯著增加（P＜0.01）；與模型對照組比較，CLM組大鼠OFT 距離與時間、TST 與FST 靜止時間均顯著減少（P＜0.01）。詳見表1。

表1 各組大鼠血清SOD及GSH-Px與行為學測試結果比較（，n=6）Tab.1 Comparison of the levels of serum SOD and GSH - Px and the behavioral test results of rats in each group（，n=6）

注：與正常對照組比較，*P ＜0.01；與模型對照組比較，#P ＜0.01。表2至表3和圖1同。Note：Compared with those in the normal control group，*P ＜0.01；Compared with those in the model control group，#P ＜0.01（for Tab.1 - 3 and Fig.1）.

FST靜止時間（s）59.25±4.77 89.64±6.28*66.22±5.42#組別正常對照組模型對照組CLM組SOD（U/mL）156.32±11.02 104.22±8.65*132.32±12.45#GSH-Px（U/mL）319.65±22.65 166.55±12.32*223.25±18.65#OFT距離（mm）13 562.00±136.51 17 413.34±256.22*15 423.74±214.62#OFT時間（s）36.27±5.52 63.64±4.33*48.78±4.46#TST靜止時間（s）58.36±3.81 108.23±6.53*81.38±8.12#

2.2 對海馬神經炎性因子水平的影響

與正常對照組比較，模型對照組大鼠IL-1β，TNF-α含量均顯著增加（P＜0.05），IL-10含量顯著下降（P＜0.05）；與模型對照組比較，CLM組大鼠IL-1β，TNF-α含量均顯著減少（P＜0.01），IL-10含量顯著增加（P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠血清炎性因子水平比較（，pg/mL，n=6）Tab.2 Comparison of serum inflammatory factor levels of rats in each group（，pg/mL，n=6）

表2 各組大鼠血清炎性因子水平比較（，pg/mL，n=6）Tab.2 Comparison of serum inflammatory factor levels of rats in each group（，pg/mL，n=6）

IL-10 89.22±5.56 41.29±6.20*69.72±4.04#組別正常對照組模型對照組CLM組IL-1β 125.48±14.17 267.86±22.31*156.37±23.12#TNF-α 77.39±8.21 148.58±11.16*123.47±9.52#

2.3 對BDNF/TrkB/CREB 信號通路相關蛋白表達水平的影響

采用Western blot 法檢測BDNF/TrkB / CREB 通路中的標志性蛋白［27］。與正常對照組比較，模型對照組大鼠BDNF 與Trkb 蛋白表達水平與p - CREB/ CREB均顯著下降（P＜0.05）；與模型對照組比較，CLM 組大鼠BDNF 和TrkB 蛋白表達水平與p - CREB/ CREB 均顯著上升（P＜0.01）。結果表明，CLM 通過BDNF/TrkB/CREB 信號通路改善腫瘤后抑郁模型大鼠抑郁狀態。詳見表3和圖1。

圖1 各組大鼠海馬BDNF，TrkB，CREB，p - CREB 蛋白質印跡圖Fig.1 Western blot of BDNF，TrkB，CREB，and p-CREB in the hippocampal tissue of rats in each group

表3 各組大鼠腦組織BDNF/TrkB/CREB 信號通路相關蛋白表達水平比較（，n=6）Tab.3 Comparison of expression levels of BDNF/TrkB/CREB signaling pathway-related proteins in brain tissues of rats in each group（，n=6）

表3 各組大鼠腦組織BDNF/TrkB/CREB 信號通路相關蛋白表達水平比較（，n=6）Tab.3 Comparison of expression levels of BDNF/TrkB/CREB signaling pathway-related proteins in brain tissues of rats in each group（，n=6）

p-CREB/CREB 0.51±0.03 0.26±0.04*0.41±0.03#組別正常對照組模型對照組CLM組BDNF 0.76±0.04 0.36±0.04*0.68±0.03#TrkB 0.86±0.04 0.31±0.05*0.66±0.04#

3 討論

抑郁癥及伴隨其他疾病的抑郁癥治療仍是重大挑戰。CLM 已長期安全、有效地用于包括抑郁癥在內的許多疾病的治療，本研究中進一步評估了CLM 是否具有快速抗抑郁作用和其抗抑郁的潛在作用機制。結果顯示，CLM 抑制了腫瘤后服模型大鼠體內的氧化應激水平，起到了抗抑郁樣作用，增加了海馬中BDNF 的表達，表明與CLM的抗抑郁樣作用有關。

研究表明，CLM 的即時抗抑郁活性與越鞠丸或氯胺酮相當，但CLM 的抗抑郁作用持續時間不及越鞠丸或氯胺酮［28-29］。但CLM 的快速誘導抗抑郁及其效應劑量僅為其他藥物臨床劑量的1/2，如越鞠丸需高于臨床劑量才能產生快速的抗抑郁樣作用［30］。黃芩苷是CLM制劑中富集最多的化合物，具有多種藥理活性，如抗炎和促進神經發生能力［31-32］，還表現出了抗抑郁樣作用［33-34］，這與海馬體中BDNF的增加有關［35-36］。

BDNF 及其受體TrkB 在神經回路的形成中具有重要作用，并廣泛參與了許多神經精神障礙疾病的形成［37］。一項臨床研究的系統綜述和薈萃分析表明，BDNF 直接參與抑郁癥的病理過程，且BDNF 的表達恢復可能是抗抑郁產生療效的基礎［38-39］；抑郁降低了海馬組織中BDNF mRNA 和蛋白的表達，但不降低前額皮質的表達［40-41］。均與本研究中腫瘤后抑郁使大鼠降低了海馬組織中BDNF 和TrkB 的蛋白表達水平一致。CLM 治療恢復了海馬組織中BDNF 和TrkB 的表達水平，BDNF/TrkB 信號可增加海馬CA1 區錐體神經元的樹突棘密度［42］，海馬組織中的BDNF 在慢性不可預測的輕度應激誘導的抑郁樣行為和海馬錐體神經元中樹突棘的改變中起關鍵作用［43］。而BNDF/TrkB 途徑可依賴CREB 影響神經元功能［44］。JEE 等［45］報道，BNDF 作為抑郁癥病因學中關鍵的神經營養因子，炎癥與抑郁樣行為息息相關，可通過炎癥途徑改善抑郁癥。本研究結果顯示，BDNF/TrkB/CREB 信號的失活是腫瘤后抑郁發生的重要機制，可通過此信號通路改善神經炎癥與抑郁樣行為。海馬區存在豐富的其他因素串擾影響抑郁癥的發生，本研究中僅從單一的角度探討CLM 改善腫瘤后抑郁的調節機制，后續研究將從細胞水平、臨床水平進一步探究腫瘤后抑郁的相關機制。