基于Wnt/β-聯蛋白信號通路探討堅骨膠囊對骨質疏松癥模型大鼠骨代謝的影響*

金穎慧，閆國強，張俊艷，張 倩，丁洪青，董晶晶，李寶芬，馮娜娜，孫 越

（河北省滄州中西醫結合醫院，河北 滄州 061000）

骨質疏松癥是以骨密度降低、骨微結構損壞、骨脆性增加為特征的一種全身慢性代謝性疾病，骨代謝失衡為其主要發病機制［1-2］。Wnt/β -聯蛋白（β-catenin）信號通路通過調控成骨細胞、破骨細胞，影響骨形成和骨代謝，可達到改善骨質疏松癥的作用［3］。堅骨膠囊為醫院制劑，主要由黃芪、三七、制川烏、制草烏、醋乳香、醋沒藥、川芎、紅花、膽南星、鱉甲、珍珠等組方，具有補腎益氣、祛瘀止痛作用，治療骨質疏松癥療效較好，但作用機制尚不明確。前期研究證明，堅骨膠囊可有效預防大鼠骨質疏松［4］，但其對骨質疏松的治療效果尚不明確。故本研究中基于Wnt/β- catenin 信號通路探討了堅骨膠囊對骨質疏松癥模型大鼠骨代謝的影響及其作用機制，為其治療骨質疏松癥提供動物實驗依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：MultiSkan3型全自動酶標分析儀，Fresco 型低溫冷凍離心機，均購于美國Thermo公司；056 型電泳儀（美國Bio - Rad 公司）；GENIUS 5K 型電動組織勻漿器（美國Fluka公司）；sky can1076型Micro-CT儀（上海賽新生物科技有限公司）。

試藥：堅骨膠囊（醫院制劑，批號為191107，規格為每粒0.35 g）；仙靈骨葆膠囊（國藥集團同濟堂＜貴州＞制藥有限公司，批號為Z20025357，規格為每粒0.3 g）；降鈣素（CT）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號為M - 0571R2），抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）ELISA 試劑盒（批號為MM0689R2），骨保護素（OPG）ELISA 試劑盒（批號為M - 0115R1），生長激素（GH）ELISA 試劑盒（批號為MM - 0502R2），均購于江蘇酶免實業有限公司；Wnt 檢測試劑盒（批號為YM2373），β-catenin 檢測試劑盒（批號為YM3403），糖原合成酶激酶- 3β（GSK - 3β）檢測試劑盒（批號為YM3507），骨形成蛋白-2（BMP-2）檢測試劑盒（批號為YM2507），均購于美國Immunoway公司。

動物：SPF 級Wistar 大鼠48 只，雌性，體質量180～220 g，購于河北醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號為SCXK（冀）2018-004，飼養環境溫度22 ℃，相對濕度60%，自然光源，標準飼養，自由飲水1 周，適應環境。動物實驗經我院倫理委員會批準（審查意見編號為2020KY038）。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模與給藥

將48 只Wistar 大鼠隨機分為空白對照組（A 組，等量生理鹽水），模型對照組（B 組，等量生理鹽水），仙靈骨葆組［C組，468 mg/（kg·d）］，以及堅骨膠囊高、中、低劑量組［D1組、D2組、D3組，2 184，1 092，546 mg/（kg·d）］，各8 只。除A 組大鼠灌服純化水外，其余各組大鼠每日灌服維甲酸100 mg/ kg，連續4 周，建立骨質疏松癥模型［5］；造模成功4 周后，各組大鼠灌胃相應藥物或生理鹽水，每日1次，連續8周。

1.2.2 觀察指標

股骨微結構及其指標：取血后，各組大鼠脫頸處死，取左側股骨，用浸潤生理鹽水的紗布包裹，冷凍保存。采用Micro-CT儀掃描重建股骨，檢測遠心端感興趣區股骨結構模型指數（SMI）、骨密度（BMD）、骨表面積與組織體積比（BV/TV）、骨表面積與骨體積比（BS/BV）、骨小梁數量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）。

骨代謝生化指標：于大鼠眼球后靜脈叢采血2 mL，離心，取血清，采用ELISA 檢測各組大鼠血清中CT，TRACP，OPG，GH的含量。嚴格按試劑盒標準步驟操作。

蛋白表達：取大鼠右側股骨，采用RIPA 蛋白抽提試劑提取組織中蛋白并定量，加入緩沖液煮沸變性，20μg上樣；300 mA 橫流轉模3 h，用3%牛血清白蛋白（BSA）封閉30 min；加入Wnt1，β-catenin，GSK-3β，BMP-2一抗（稀釋度均為1∶1 000），室溫孵育10 min，4 ℃過夜，室溫孵育30 min；TBST 洗膜5 次，每次3 min；加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（稀釋度均為1∶10 000），室溫封閉2 h，TBST洗膜6次，每次3 min；采用電致化學發光（ECL）試劑盒顯色、曝光、定影，采用凝膠定量分析軟件TotalLab Quant 讀取條帶的積分光密度（IOD）值，以β-肌動蛋白（β-actin）為內參，采用Image軟件計算Wnt1，β- catenin，GSK - 3β，BMP - 2 蛋白的相對表達水平。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 大鼠股骨微結構及其指標

A 組大鼠股骨遠心端骨小梁多呈板狀，致密均勻；B 組大鼠股骨遠心端骨小梁多呈桿狀，稀疏；C 組、D1組大鼠骨小梁結構最完整，與A組接近。詳見圖1。

圖1 堅骨膠囊對骨質疏松癥模型大鼠股骨微結構的影響Fig.1 Effect of Jiangu Capsules on microstructure of femur in osteoporosis model rats

與A 組比較，B 組大鼠SMI 和Tb. Sp 均顯著升高（P＜0.05），BMD，BV/ TV，BS/ BV，Tb. N，Tb. Th 均顯著降低（P＜0.05）；與B組比較，C組和D1組大鼠SMI和Tb. Sp 均顯著降低（P＜0.05），BMD，BV/ TV，BS/ BV，Tb.N，Tb.Th均顯著升高（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠股骨微結構指標比較（，n=8）Tab.1 Comparison of microstructure indexes of femur of rats in each group（，n=8）

表1 各組大鼠股骨微結構指標比較（，n=8）Tab.1 Comparison of microstructure indexes of femur of rats in each group（，n=8）

注：與A組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與B組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。表2和圖2同。Note：Compared with those in group A，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；compared with those in group B，*P ＜0.05，**P ＜0.01（for Tab.1-2 and Fig.2）.

組別A組B組C組D1組D2組D3組Tb.Sp（μm）606.19±88.75 896.39±78.37△△638.48±34.75**650.58±79.72**833.49±92.12 853.40±88.18劑量［mg/（kg·d）］468 2 184 1 092 546 SMI 1.37±0.07 2.39±0.36△△1.50±0.41**1.45±0.29**2.08±0.53 2.21±0.44 BMD（g/cm3）0.23±0.05 0.15±0.02△△0.19±0.03*0.20±0.03*0.17±0.04 0.15±0.06 BV/TV（%）23.00±2.58 13.10±2.96△△18.87±2.50**18.06±4.19*15.09±4.18 14.20±3.09 BS/BV（mm -1）49.01±12.46 31.36±9.53△42.76±8.45*45.03±7.54*29.71±10.11 30.94±9.69 Tb.N（mm -1）1.82±0.64 1.24±0.34△1.75±0.52*1.70±0.26*1.46±0.74 1.30±0.46 Tb.Th（μm）98.09±8.15 85.00±5.91△△93.66±5.63*92.79±5.31*87.72±9.25 85.61±9.55

2.2 大鼠骨代謝生化指標

與A 組比較，B 組大鼠血清CT，OPG，GH 水平均顯著降低（P＜0.01），TRACP 水平顯著升高（P＜0.01）；與B 組比較，C 組和D1組大鼠血清CT，OPG，GH 水平均顯著升高（P＜0.05），TRACP水平顯著降低（P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠骨代謝生化指標比較（，ng/mL，n=8）Tab.2 Comparison of biochemical indexes of bone metabolism of rats in each group（，ng/mL，n=8）

表2 各組大鼠骨代謝生化指標比較（，ng/mL，n=8）Tab.2 Comparison of biochemical indexes of bone metabolism of rats in each group（，ng/mL，n=8）

組別A組B組C組D1組D2組D3組劑量［mg/（kg·d）］468 2 184 1 092 546 CT 4.48±1.21 1.87±0.58△△3.28±0.83**3.25±0.56**2.05±0.56 1.96±0.73 TRACP 8.40±1.16 14.53±2.78△△9.15±2.83**9.41±1.34**10.73±1.26*11.98±2.31 OPG 5.33±0.87 3.47±0.47△△4.42±0.97**4.77±1.17*4.26±1.02 3.94±0.61 GH 26.35±3.91 15.14±3.11△△23.91±2.60**24.05±3.04**20.20±4.45*16.62±3.14

2.3 大鼠股骨組織中蛋白表達水平

與A 組比較，B 組大鼠股骨組織中Wnt1，β-catenin，GSK - 3β，BMP - 2 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.01）；與B 組比較，C 組和D1組大鼠股骨組織中Wnt1，β- catenin，GSK - 3β，BMP - 2 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）。詳見圖2。

圖2 各組大鼠股骨組織中蛋白表達水平比較Fig.2 Protein expression levels in femoral tissue of rats in each group

3 討論

骨質疏松癥主要分為原發性、繼發性及特發性［6］。其中，原發性骨質疏松癥最常見，可分為絕經后骨質疏松癥和老年性骨質疏松癥。絕經后骨質疏松癥在原發性骨質疏松癥中占比較高，屬中醫“骨痿”“骨痹”等范疇。腎虛是絕經后骨質疏松癥發生、發展的重要病機［7］。堅骨膠囊具有補腎益氣、活血止痛之功效［8］。仙靈骨葆膠囊可促進成骨細胞增加與繁殖，抑制破骨細胞的相關通路而增加骨量，還可作用于免疫及血管生成相關通路，有助于改善骨微環境，治療骨質疏松癥［9-10］。故本研究中選用仙靈骨葆膠囊為陽性對照藥物。

骨微結構是反映骨質疏松癥的重要指標，SMI，BMD，BV/ TV，BS/ BV，Tb. N，Tb. Th，Tb. Sp 等反映骨小梁結構狀況，對骨質疏松癥的判斷有重要作用［11］。由圖1 可知，D1組大鼠骨小梁呈板狀，與A 組接近；由表1可知，與B 組比較，D1組大鼠SMI 和Tb. Sp 均顯著降低（P＜0.01），BMD，BV/ TV，BS/ BV，Tb. N，Tb. Th 均顯著升高（P＜0.05），表明堅骨膠囊可明顯改善大鼠的骨小梁結構和骨質疏松。

骨質疏松癥由骨轉換失調所致，CT，TRACP，OPG，GH 為常見骨代謝生化指標，在骨轉換過程中發揮重要作用［12］。CT 是一種多肽類激素，參與調節鈣磷代謝，對破骨細胞和成骨細胞有一定影響［12］。OPG 為骨形成標志物，具有抑制破骨細胞產生、促進破骨細胞凋亡作用，進而影響骨代謝［13］，絕經后女性雌激素水平降低，破骨細胞活性升高，機體轉為代償性骨吸收，骨形成增加，導致OPG 升高［14］。TRACP 為骨吸收標志物，多數存在于肺泡巨噬細胞和破骨細胞中，在正常人血清中以TRACP - 5a 和TRACP - 5b 的形式存在，其中TRACP - 5a 主要存在于炎性巨噬細胞中，TRACP - 5b 主要存在于破骨細胞中。絕經后骨質疏松癥患者雌激素水平降低，破骨細胞活躍，骨重建失衡，骨吸收大于骨形成，導致TRACP- 5b 水平升高。GH 具有促進細胞分化、增殖的作用［15］，通過影響破骨細胞的前體細胞及成熟破骨細胞，達到調節骨吸收的作用，并能刺激前體細胞向成骨細胞分化，促進骨細胞、軟骨細胞增殖［16-17］。GH 分泌不足者的BMD 低于正常人，其分泌水平隨著年齡的增長而逐漸降低，BMD 也隨之降低［18］。由表2 可知，與B 組比較，D1組大鼠血清中CT，OPG，GH 水平均顯著升高，TRACP 水平顯著降低，提示堅骨膠囊通過調節骨代謝達到治療骨質疏松癥的目的。

當激活Wnt/β- catenin 信號通路時，Wnts 會發生一系列下游事件的聯級反應，使β- catenin 進入細胞核，啟動大量靶基因的轉錄［19］。Wnt 具有影響前體細胞向成骨細胞分化的作用，成骨細胞外Wnt 蛋白與細胞膜上受體LRP5/ 6 結合后，通過與細胞質中的Dsh蛋白（Dsh）、GSK - 3β、軸蛋白（Axin）、Dickkopf 相關蛋白（DKKs）等彼此作用形成二聚體，導致β- catenin 水平升高并進入細胞核，TCF/ LEF1 影響Runx 相關轉錄因子（Runx2）和Osterix 的表達，從而促進成骨細胞的增殖與分化［20-22］。BMP 在成骨細胞分化中具有重要作用，BMP - 2 激活后會與磷酸化的Smad1/ 5/ 8 和Smad4 形成復合物，將其轉入細胞核以激活Runx2 的轉錄［23］。BMP 在參與成骨細胞調節的過程中，以多種機制促進Wnt /β- catenin 信號的傳導［24］。由圖2可知，與B 組比較，D1組大鼠股骨組織中Wnt1，β- catenin，GSK - 3β，BMP - 2 蛋白表達水平均顯著升高，表明堅骨膠囊可能通過影響Wnt/β- catenin 信號通路促進骨形成，抑制骨吸收，調節骨代謝，進而減少骨量丟失。

綜上所述，堅骨膠囊能有效增強骨質疏松癥模型大鼠的BMD 和骨強度，調節骨代謝平衡，其作用機制可能與Wnt/β-catenin信號通路密切相關。