雙孢蘑菇凝集素對(duì)兔耳創(chuàng)面愈合增生性瘢痕的作用研究*

林平發(fā)，林勇，林婷婷

（福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350101）

瘢痕是創(chuàng)傷修復(fù)的必然結(jié)果，增生性瘢痕（Hypertrophic scars,HS）是手術(shù)后、燒傷、創(chuàng)傷等常見的病理性修復(fù)的異常結(jié)果。成纖維細(xì)胞的異常增殖，膠原在細(xì)胞外基質(zhì)組織中過度沉積，而降解不足是導(dǎo)致增生性瘢痕形成的原因[1]。增生性癱痕是整形外科常見疾病，在我國(guó)有比較高的發(fā)病率，目前對(duì)其防治仍是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的難題之一，因此尋找預(yù)防和治療瘢痕增生的藥物具有重要的意義。本研究建立兔耳增生性瘢痕模型，來(lái)觀察雙孢蘑菇凝集素對(duì)增生性瘢痕的影響，為增生性瘢痕的治療藥物的臨床開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

成年雄性新西蘭大白兔12只，體重（2±0.5）kg，由上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)提供[許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2017-0008]，雙孢蘑菇凝集素購(gòu)自Cosmo Bio Co.Ltd（批號(hào)lot.32508A）。大白兔在實(shí)驗(yàn)全過程中均采取單籠喂養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 瘢痕模型制作

大白兔適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，采取耳緣靜脈麻醉，避開可見血管用手術(shù)刀去除兔耳腹面皮膚及軟骨膜，制作1 cm×1 cm大小的圓形創(chuàng)面，創(chuàng)面間隔2.5 cm以上，每耳4處創(chuàng)面，共96個(gè)創(chuàng)面，創(chuàng)面暴露不做包扎，待其自行愈合形成瘢痕[2]。在術(shù)后30 d左右創(chuàng)面周圍隆起形成增生性瘢痕，隨機(jī)取樣，經(jīng)病理切片證實(shí)為增生性瘢痕組織。

1.2.2 分組給藥

將兔隨機(jī)分為4組，每組3只（共24個(gè)瘢痕），分別為：空白組（生理鹽水組），高（400 mg /L）、中（200 mg /L）、低（100 mg /L）劑量雙孢蘑菇凝集素組。用微量注射器從創(chuàng)面周圍的正常皮膚進(jìn)針向創(chuàng)面基底部及創(chuàng)面灶內(nèi)行局部注射，隔日1次，每個(gè)瘢痕組織注射20μL至皮膚蒼白并稍微隆。28 d后處死動(dòng)物，切取瘢痕標(biāo)本組織。

1.3 指標(biāo)觀察

觀察瘢痕組織外觀大體形態(tài)變化，測(cè)量28 d的兔耳瘢痕厚度及瘢痕增生指數(shù)（Hypertrophic Index,HI）。用微尺測(cè)量相對(duì)增生厚度，設(shè)定瘢痕的高度（Scar height）為SH，正常皮膚高度（dermis height）為DH，則HI=SH/DH，計(jì)算對(duì)比各組瘢痕增生指數(shù)（HI）[3]。HE染色觀察28 d瘢痕組織成纖維細(xì)胞變化情況，于光鏡下觀察PCNA及CD34的蛋白表達(dá)情況。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行PCNA陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率%=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，結(jié)果取平均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，其中p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘢痕外觀形態(tài)觀察

造模30 d后兔耳腹部形成明顯的不同程度凸起斑塊，高于周圍正常皮膚，色淡紅，質(zhì)硬。在治療28 d后，治療組的瘢痕變軟，色素變淡，硬塊明顯變小，瘢痕厚度低于空白組。

2.2 瘢痕厚度及瘢痕增生指數(shù)測(cè)定

測(cè)定治療后28 d瘢痕厚度，計(jì)算瘢痕增生指數(shù)（HI）。可見隨著劑量的增加，瘢痕厚度逐漸降低。結(jié)果見表1。

表1 治療28 d瘢痕厚度及瘢痕增生指數(shù)、PCNA陽(yáng)性表達(dá)率（±s,mm,n=24）

表1 治療28 d瘢痕厚度及瘢痕增生指數(shù)、PCNA陽(yáng)性表達(dá)率（±s,mm,n=24）

注：“*”與生理鹽水組比較，P＜0.05。

組別空白組低劑量組中劑量組高劑量組厚度（mm）3.83±0.75 3.39±0.65 2.87±0.69*2.26±0.63*增生指數(shù)（HI）3.48±0.68 3.08±0.60 2.61±0.63*2.06±0.57*PCNA陽(yáng)性表達(dá)率65.2±9.1 58.3±6.7 49.5±5.1*37.2±5.1*

2.3 瘢痕組織HE染色切結(jié)果觀察

在光鏡下可觀察到，空白組鱗狀上皮下瘢痕組織明顯增厚，大量梭形成纖維細(xì)胞增生，密集排列，局部伴玻璃樣變性，其間多見慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，周圍毛細(xì)血管增生明顯（圖1）。在治療28 d后，隨著藥物劑量的增加，瘢痕組織鱗狀上皮下成纖維細(xì)胞排列較疏松，增生密度降低，炎癥細(xì)胞及毛細(xì)血管數(shù)量減少，玻璃樣變性更明顯（圖2、圖3、圖4）。

圖1 空白組

圖2 低劑量組

圖3 中劑量組

圖4 高劑量組（均質(zhì)紅染無(wú)結(jié)構(gòu)狀物明顯增多）

2.4 瘢痕組織免疫組化染色結(jié)果觀察

2.4.1 PCNA表達(dá)情況

PCNA 陽(yáng)性定位于成纖維細(xì)胞核，呈棕色顆粒狀，免疫組化染色結(jié)果可見PCNA表達(dá)與雙孢蘑菇凝集素劑量負(fù)相關(guān)，高劑量組的PCNA表達(dá)明顯下降。結(jié)果見圖5、圖6、圖7、圖8。PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率結(jié)果見表1。

圖5 空白組

圖6 低劑量

圖7 中劑量

圖8 高劑量

2.4.2 CD34表達(dá)情況

CD34 陽(yáng)性定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞漿/膜，可清晰顯示毛細(xì)血管腔環(huán)形結(jié)構(gòu)，隨著雙孢蘑菇凝集素劑量的增加CD34表達(dá)明顯下降。治療28 d后免疫組化染色結(jié)果見圖9、圖10、圖11、圖12。

圖9 空白組

圖10 低劑量

圖11 中劑量

圖12 高劑量

3 討論

機(jī)體受到創(chuàng)傷、燒傷等會(huì)導(dǎo)致皮膚纖維結(jié)締組織過度修復(fù)從而導(dǎo)致增生性瘢痕的形成，同時(shí)多種細(xì)胞因子如生長(zhǎng)因子（TGF-β）和各種細(xì)胞通路等也會(huì)促進(jìn)瘢痕增生[4]。增生性瘢痕會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)如疼痛、瘙癢等癥狀，還會(huì)形成色素沉著，影響美觀和功能，甚至給患者帶來(lái)心理負(fù)擔(dān)。因此對(duì)于創(chuàng)傷等導(dǎo)致的增生性瘢痕的治療顯得意義重大。目前對(duì)瘢痕的治療方法比較多，一般包括藥物治療、手術(shù)切除、物理治療等[5]，但效果差強(qiáng)人意，因此需要尋找新的藥物來(lái)更好地治療增生性瘢痕。

雙孢蘑菇，學(xué)名Agaricus bisporus，在分類上隸屬真菌門，擔(dān)子菌綱，無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱，傘菌目，蘑菇科，蘑菇屬。凝集素是一類非免疫起源的蛋白或糖蛋白，具有糖專一性結(jié)合位點(diǎn)，廣泛存在于各種動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌以及病毒中，由于其中不少種類具有抗病原菌、殺滅昆蟲、調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境、抗腫瘤等功能使得凝集素逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)之一[6]。目前雙孢蘑菇凝集素抑制細(xì)胞增殖這一研究較少，過度的細(xì)胞增殖是增生性瘢痕的直觀特點(diǎn)，而雙孢蘑菇凝集素的細(xì)胞增殖抑制活性使得雙孢蘑菇凝集素在增生性瘢痕治療方面或許具有潛在的治療價(jià)值[7]。

本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建兔耳增生性瘢痕模型，在兔耳腹形成瘢痕后，給予局部注射雙孢蘑菇凝集素進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)瘢痕組織的影響。發(fā)現(xiàn)在干預(yù)28d后實(shí)驗(yàn)組瘢痕厚度變低、質(zhì)地變軟，治療組瘢痕組織厚度及瘢痕增生指數(shù)（HI）低于對(duì)照組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組的HE染色結(jié)果顯示，隨著藥物劑量的增加，瘢痕組織中成纖維細(xì)胞增生密度降低，排列較規(guī)整，炎癥細(xì)胞及毛細(xì)血管數(shù)量減少，說(shuō)明隨著濃度增加，雙孢蘑菇凝集素可抑制瘢痕組織細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)組的PCNA及CD34蛋白表達(dá)明顯下降，呈劑量負(fù)相關(guān)，并且PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于空白組（P＜0.05），表明雙孢蘑菇凝集素抑制瘢痕組織纖維細(xì)胞的異常增殖，可能與減少瘢痕組織細(xì)胞PCNA及CD34蛋白的表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)開展雙孢蘑菇凝集素對(duì)瘢痕增生防治作用的研究，對(duì)于研發(fā)減輕或消除瘢痕造成的各種畸形的治療藥物以及進(jìn)一步開發(fā)利用雙孢蘑菇資源提供理論依據(jù)。