蝦肝腸胞蟲研究進展

江海儀，李婉瑩，高煥，2，3*

（1.江蘇海洋大學，江蘇省海洋生物資源與環境重點實驗室，江蘇省海洋生物技術重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，江蘇 連云港 222005；3.江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，江蘇 南京 210014）

肝胰腺微孢子蟲病（hepatopancreatic microsporidiosis, HPM），由蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei,EHP）侵染蝦類的肝胰腺引起[1]。2004 年最早在泰國斑節對蝦（Penaeus monodon）的肝胰腺中[1]發現EHP，2009 年經組織學、超微結構和系統發育數據分析，被成功分離并命名為EHP。多種重要經濟養殖蝦類會被EHP 侵染，如凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、日本對蝦（Penaeus japonicus）、脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）等[2]，感染后的個體生長速度遲緩[1]。盡管在早期研究中觀察到EHP流行率和感染程度較低[1]，但EHP 引起的HPM，仍在一些亞洲國家（包括泰國、印度、越南、馬來西亞、印度尼西亞和中國等）蝦類養殖業中蔓延，造成較大的經濟損失[2]。在對蝦的研究中還發現另一種微孢子蟲——對蝦八疊胞蟲（Agmasoma penaei），它主要感染機體的結締組織和肌肉，會導致蝦的肌肉呈乳白色，肌肉纖維退化[1-8]。而嚴重感染EHP 的脊尾白蝦肌肉也會發白，但是主要被侵染組織為肝胰腺和腸道，主要臨床表現為生長速度緩慢，可以正常攝食，通常出現軟殼、嗜睡、攝食量減少和中腸空虛等現象[9-10]。嚴重感染EHP 的蝦類，肝胰腺出現萎縮，可能會因感染其他細菌或病毒導致死亡[11-12]。有研究表明，感染EHP 的蝦，感染急性肝胰腺壞死病（AHPND）和膿毒性肝胰腺壞死（SHPN）的概率上升[13]。被感染蝦的肝小管上皮細胞脫落明顯，在管腔中觀察到大量的孢子聚集[1]，腸道菌群結構被破壞[14]，蝦腸道微生物區系、細菌介導功能、消化和免疫活動發生改變，蝦的生長機能受到抑制[15]。由于EHP 具有由幾丁質和蛋白質構成的胞壁，目前各種治療手段效果均欠佳，主要側重研究預防方法[1]。

1 EHP 生物學特性

EHP 歸類于真菌界、微孢子蟲門[16]，與分支在真菌界的隱真菌門是姊妹門[17]。EHP 基本結構包括高電子密度外壁、低電子密度內壁、原生質膜組成的胞壁、錨定盤[16]、胞原質、細胞核[16]、極膜層以及特殊的侵染裝置——極管等[16]。成熟EHP 孢子在光學顯微鏡鏡下呈直徑為（0.7±1.1）μm 的橢圓形[16]，孢子頂端的錨定盤與極管相連接[7]。EHP 孢子在細胞膜周圍有一層厚厚的保護性幾丁質壁，使它們能夠在宿主外存活并參與微孢子蟲的發病機制[18]。

EHP 生活史可劃分為3 個階段，包括宿主體外的感染期、宿主細胞內的裂增殖期和孢子增殖期，與之對應的是孢子、母孢子與孢子母細胞[3]。因為成熟的EHP 孢子是EHP 在宿主細胞外的載體[16]，所以在宿主體外成熟孢子通過彈出極管，釋放孢原質，讓孢原質（孢子）通過被刺穿的細胞質膜進入宿主細胞內[3]。在宿主細胞入侵過程中，環境刺激讓孢子萌發，通過外翻釋放極管，孢原質通過極管轉移到宿主細胞的細胞質中，孢原在此發育并完成生命周期[19]。Aldama-Cano 等[20]利用Phloxin B 染色，發現可通過擠壓其極管來測量純化的EHP 孢子的活性。Jaroenlak 等[21]鑒定了EHP 的第一個孢壁蛋白（EhSWP1），發現EhSWP1 定位于孢子內壁和外壁，能夠利用其N 端的3 個肝素結合基序（HBMs），在感染過程中參與了孢子與宿主細胞表面肝素（一種氨基葡聚糖）的連接。裂增殖期是一個非傳染性階段，孢原質進入宿主細胞后與細胞質直接接觸，孢子通過截取宿主營養物質進行核分裂，發育成熟后成為裂殖體并發生變異，當變異的母孢子積累到一定程度，便進入孢子增殖期[3]。這一時期代表了EHP的增殖期，在宿主細胞中有多核的細胞質，含有許多細胞核[16]。孢子增殖期是宿主細胞的多細胞階段，該時期宿主的肝胰腺被感染，肝小管上皮細胞破裂[1]，釋放的成熟孢子可以感染自身其他肝小管細胞或通過糞便進入水體環境中感染其他蝦[1]。

2 流行與傳播途徑

EHP 于2013 年在我國被檢出，其引發的對蝦HPM 在我國主要對蝦養殖區流行。如2015 年浙江省接近四分之一（23.1%）的凡納濱對蝦蝦苗攜帶EHP[22]；同年遼寧省三分之一以上（34.6%）的凡納濱對蝦病蝦中都能檢測到EHP[23]；2015—2016 年江蘇如東地區因養殖對蝦感染EHP，生長受影響，導致產量下降15%～30%[24]。除了在我國眾多省市被檢出，EHP 在泰國、越南、印度等國家亦被發現。在泰國，由EHP 引起的對蝦肝胰腺微孢子蟲病與對蝦白斑綜合征、急性肝胰腺壞死病，共同成為對蝦養殖產業的重大問題，對養殖區造成了巨大影響[25]。

EHP 可以通過攝食被EHP 污染的飼料、餌料、病蝦殘體以含有成熟孢子的養殖水體進行水平傳播，也可以由母代宿主傳遞給子代宿主進行垂直傳播[12]。Salachan 等[26]將感染EHP 的對蝦和健康蝦混合養殖，導致EHP 侵染健康蝦；而Pattarayingsakul 等[27]通過對養殖感染EHP 對蝦的水體進行孢子活性檢測，并用養殖過病蝦的水體養殖健康凡納濱對蝦，證明EHP 可以進行水平傳播。在其他的微孢子蟲研究中，會用其存在于宿主的性腺組織，證明這些微孢子蟲可垂直傳播[28]。但原位雜交（ISH）試驗檢測感染EHP 的幼蝦和親蝦的性腺、肝胰腺組織，發現性腺組織中沒有EHP 陽性信號[29]，而肝胰腺中出現陽性信號[29]。該研究沒有檢測各個生命階段的蝦，且取樣數量有限，并不能證明EHP 無法實現垂直傳播[30]。文獻[30]研究發現，被投喂病蝦組織的凡納濱對蝦親蝦，其孵化池中的無節幼體會被EHP 侵染，這可能是通過水平傳播給孵化場中的后代，因為處于N6 階段的無節幼體，以浮游生物為食，此時會受到侵染[29]。程東遠[31]對中國4 個不同地區的凡納濱對蝦群體進行對蝦生長參數測量，并檢測各群體對蝦的肝胰腺組織中的EHP 感染載量，發現群體樣本數和EHP 對數因地區不同而存在差異，認為EHP 的傳播方式因群體而異。

3 病理癥狀

蝦肝腸胞蟲不會在蝦體外部造成可見的跡象，但它確實減緩了其生長速度[16]。飼料系數的下降也是感染EHP 對蝦的臨床癥狀[32]。此外，感染EHP 的對蝦容易受到繼發性細菌和病毒感染[33]。自2003 年以來，在泰國養殖的斑節對蝦中發現了EHP，感染的對蝦表現為生長緩慢綜合征（MSGS），并與斑節桿菌病毒（MBV）、肝胰腺細小病毒（HPV）和弧菌等條件病原體混合感染[34]。膿毒性肝胰腺壞死（SHPN）和EHP病例之間的密切關聯表明，EHP 增加了蝦對弧菌的易感性[35]，因為EHP 感染會破壞肝胰管細胞，使弧菌可以定殖在脫落的細胞和暴露的基底膜。

文獻[1，36-37]研究發現，染病蝦肝胰腺組織中有EHP 孢囊和被染成妃紅色的孢子，同時肝小管上皮細胞會出現不同生命階段的EHP，感染嚴重的上皮細胞會裂解或脫落。利用被EHP 感染蝦的肝胰腺組織制作濕涂片，通過Phloxin B 染色可觀察到EHP 孢子[20]。感染EHP 的蝦肝胰腺會萎縮，腸道產生炎癥[25，38]，個別病蝦可排白便[1]。但對凡納濱對蝦的研究發現，白便綜合征（WFS）與EHP 沒有因果關聯[6]，因為曾經產生白色糞便的凡納濱對蝦池塘，即使停止產生白色糞便，池塘仍然可以檢測出EHP[39]。肝胰腺和腸道是蝦類重要的營養吸收和免疫器官，而腸道的結構和穩定性與宿主健康密切相關[39]。EHP 作為專性細胞內寄生蟲，高度依賴宿主，利用宿主細胞質中豐富的環境和擴展的轉運蛋白庫，從而危害宿主的營養和代謝途徑[40]。此外，感染EHP 的病蝦相較于健康蝦，血淋巴中白蛋量、堿性磷酸酶、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶等指標均顯著上升[41]，同時EHP 感染，會改變蝦類的腸道菌群結構，從而破壞抵御病原體入侵的重要生物屏障，影響蝦的營養代謝和免疫功能[15]。

4 檢測方法

感染EHP 的蝦癥狀并不明顯，可以通過組織學、分子生物學等方法進行檢測[12]。因為傳統的組織切片制作時間較長且流程復雜，當病蝦體內孢子含量較少時并不易被發現，不利于判斷養殖蝦類是否感染EHP。目前實驗室檢測EHP，多基于分子生物學方法，如巢式PCR、原位雜交、qRT-PCR 等，此類方法快速，靈敏度高，但對儀器設備和專業技術要求較高。如李英瑕等[42]利用環介導等溫擴增（LAMP）技術研發的EHP 檢測試劑盒，具有較高的診斷特異性和靈敏性、操作簡單、便于運輸等優勢，適用于養殖場對EHP 進行檢測。近來，有研究基于碘化丙啶可穿透微孢子蟲活細胞膜的特性和孢子具有高度折光性的特點，利用熒光增白劑染色法及與碘化丙啶共染的雙色熒光法，可快速檢測蝦肝腸胞蟲。該方法操作簡便，可在10 min 內完成初步檢測，有利于養殖生產一線對EHP 感染的檢測[20]。

5 防治措施

EHP 因其具有由幾丁質和蛋白質組成厚厚的胞壁，且營胞內寄生，目前暫無針對性藥物[7]。然而，在養殖各個環節均有可能發生EHP 感染，需要對每個可能的環節做好防范，降低感染的風險。有研究發現[43]，孢子在-20 ℃冷凍＞2 h 或分別浸泡在15 mg/L KMnO4、40 mg/L 65%活性氯或20%乙醇中15 min，其中的極絲釋放受抑制，無法形成芽體，從而失去增殖能力。基于該發現，商用飼料或餌料可以在投喂前進行冷凍處理，同時可以利用高錳酸鉀、活性氯或乙醇，對池塘進行處理。若池塘曾感染EHP，可在放苗前翻耕底泥，池底使用生石灰、高錳酸鉀等物質消毒，亦可破壞其生存環境，降低蝦類被感染的風險[44]。Pattarayingsakul 等[27]研究發現，在養殖水體中，蝦肝腸胞蟲孢子會因10 d 不充氧而失活，或用體積分數為20×10-6的次氯酸鈣（濃度90%）處理24 h，迅速滅活。為預防EHP 傳播，在進行親蝦的繁育前，應對苗種進行檢測，以防傳播，也應對池塘進行相應處理。日常的養殖管理需要及時清理病死蝦、蝦代謝廢物和糞便，嚴格把控養殖水體的水質、來源，以防水體感染；可在飼料中添加可以保護肝胰腺、腸道的物品，提升蝦免疫力。

6 結語

EHP 嚴重影響全球對蝦養殖的經濟效益，是實現健康養殖必須解決的重要問題之一。目前關于蝦肝腸胞蟲仍存在較多未研究清楚的問題，如EHP 的入侵機理、特效藥的研究開發等。因此，接下來關于蝦肝腸胞蟲的防治工作可以圍繞這幾方面開展，同時還可以繼續篩選具有抗EHP 的優良養殖品種。