基于ISSR分子標記的中華鱉種群遺傳多樣性分析

丁淑荃,吳夢曉,尤 昆,袁 娟,崔鑫炎,黃 梅,謝俊杰,米 笛

(1.安徽農業大學動物科技學院,安徽合肥 230000;2.肥東縣水產技術推廣站,安徽合肥 231600 ;3.定遠縣綠色親情種養殖專業合作社,安徽滁州 233200)

中華鱉(Pelodiscussinensis)因其蛋白質含量豐富,藥用價值高,成為我國經濟價值最高,養殖規模最大的龜鱉類,2021年鱉類的養殖總產量可達364 878 t[1]。我國中華鱉種質資源豐富,但缺乏有效的亞種分化,常把不同地理種群的名作為中華鱉的同物異名;盡管在分類學中它們同屬于中華鱉,但不同水系和地理居群的品系之間存在巨大的生理和性狀差異。具有良好經濟性狀的各品系鱉可以為種質研究和良種選育提供豐富的選擇性培養材料。但近年來外來鱉種的引進以及持續近交繁殖,導致中華鱉品種純度下降與質量下滑,降低了種質間遺傳多樣性[2]。目前,種質資源的嚴重退化已成為我國中華鱉產業可持續發展的重大障礙,因此現有中華鱉種質資源的遺傳多樣性的統計分析工作迫在眉睫。

此前,中華鱉常基于形態學進行分類,由于性狀受發育階段和環境因素的影響,僅顯示有限的變異,因此難以固定具體性狀并得到穩定的良種資源[3]。近年來,分子標記技術作為種群遺傳和系統發育研究中的有效手段,已成為遺傳多樣性評估中的重要方法,不僅有助于研究種群結構、分類問題,還能幫助種質鑒定,確定種質保護的優先級[4]。分子標記技術以聚合酶鏈式反應(PCR)為基礎,主要包括簡單重復序列間擴增(ISSR)、隨機擴增多態DNA(RAPD)、簡單重復序列(SSR)和擴增片段長度多態性(AFLP)[5]。ISSR作為一種基于SSR基礎的分子標記技術,已被廣泛應用于品種鑒定、基因定位、遺傳多樣性、進化及分子生態學研究[6]。譚舜等[7]建立了紅尾仙女蝦ISSR的反應體系。ISSR分析表明,崇明白山羊的公羊具備更高的遺傳水平[8];丹東和秦皇島松江鱸魚群體分化程度較低[9];分布于廣東從化的平胸龜在物種水平和居群水平的遺傳多樣性水平均要高于福建壽寧地區[10]。與SSR標記相比,ISSR不需要基因組序列,更加省時且經濟。與RAPD和RFLP相比,ISSR除了可評估密切相關的個體之間的遺傳多樣性之外,還具備可靠性、多態性高、成本低及高效等特性[11-12]。

遺傳多樣性和變異性是生物對環境變化作出適應性反應的基礎,擁有足夠豐富的遺傳多樣性的物種在應對不斷變化的環境和競爭者時具有更大的優勢[13]。因此,對中華鱉種群遺傳多樣性以及種內、種間、種群結構的研究,為中華鱉種質資源保護提供一定的研究基礎,并為新品種選育改良提供數據參考。分子標記技術以其先進的計算方法從基因層面為分析遺傳多樣性和了解種群系統發育關系提供了新的切入點。筆者利用ISSR技術對4個地方品系以及1個雜交品系的中華鱉進行分子標記,評估了不同品系中華鱉遺傳多樣性、各種群間親緣關系和遺傳結構,為輔助現有中華鱉品種選育、品種分類以及品種表征鑒定等提供基礎資料,同時為中華鱉遺傳資源的有效評價和利用提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料試驗中華鱉來自5個不同居群,均由安徽省滁州市定遠縣綠色親情種養殖專業合作社提供,具體特征和信息見表1。活體中華鱉運至實驗室暫養3 d后取樣。紗布擦拭體表,并用乙醇體表消毒后取腿部肌肉,液氮冷凍后置于-80 ℃保存備用。

表1 中華鱉5個供試居群的基礎信息

1.2 DNA的提取及檢測采用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取肌肉組織基因組DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度,超微量分光光度計檢測核酸濃度,所提取DNA的OD260/OD280為1.70～1.94,完整度良好。

1.3 PCR擴增與電泳檢測所用引物序列來源于加拿大哥倫比亞大學公布的第九套ISSR引物序列,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。篩選出10對多態性高、擴增條帶清晰的ISSR引物用于擴增(表2)。反應體系為20 μL:cDNA 2.0 μL,2×RapidTaqMaster Mix 10.0 μL,引物(10 μmol/L)0.8 μL,ddH2O 7.2 μL,擴增反應程序為:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性15 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,進行35個循環;72 ℃徹底延伸5 min,4 ℃保存。擴增后的產物通過1.5%瓊脂糖凝膠150 V電泳1 h,置于紫外凝膠成像儀中拍照保存后進行條帶統計與分析。

表2 ISSR引物序列及其擴增產物的多態性

1.4 數據統計與分析由于ISSR為顯性標記,同一引物下PCR產物電泳遷移率一致的條帶代表1個等位基因位點。根據同一位點條帶的有無記錄電泳結果,有帶的記為1,無帶的記為0,將所得數據輸入Excel表格構建0/1矩陣。統計總條帶數、多態性位點數、多態性條帶數,計算多態性條帶(PPB)比例。用Popgen 32軟件計算等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、多態性位點(PPL)比例、Nei’s基因多樣性指數(H)、居群總遺傳多樣性指數(Ht)、Shannon多樣性指數(I)、居群總遺傳多樣性指數(Ht)、居群內遺傳多樣性指數(Hs)、基因分化系數(Gst)和基因流(Nm)。用GenAlEx 6.5軟件計算遺傳一致度、遺傳距離,并進行分子方差(AMOVA)分析。用NTSYSpc 2.10e軟件以及MEGA軟件構建非加權組平均法(UPGMA)品種間聚類圖。

2 結果與分析

2.1 引物多態性用篩選出的10條引物對65個中華鱉樣本進行PCR,擴增結果見表2。共獲得123條清晰可見的條帶,其中92條條帶具有多態性,平均多態性條帶(PPB)比例為73.417%,每條引物平均擴增出的條帶數為12.3條,多態性條帶數為5～15條。引物多態性條帶比例為50.00%～93.75%。其中引物UBC854多態性條帶比例高達93.75%。圖1為用引物UBC807擴增的電泳條帶。

注:Z.雜交鱉;W.烏鱉品系;R.日本品系;T.中國臺灣品系;H.淮河品系;M.Marker,DL 2 000。

2.2 遺傳多樣性5個居群中華鱉的遺傳多樣性參數見表3。中華鱉5個居群的等位基因數(Na)為1.748 0,有效等位基因數(Ne)為1.417 7,Nei’s基因多樣性指數(H)為0.245 5,Shannon多樣性指數(I)為0.370 4,多態性位點(PPL)比例為74.80%。在中華鱉5個居群中,烏鱉群體的遺傳多樣性水平要高于其他中華鱉群體,Na為1.536 6,Ne為1.374 3,H為0.207 5,I為0.302 5,PPB為66,PPL為53.66%。淮河鱉居群的變異程度最小(Na=1.365 9,Ne=1.247 5,H=0.139 2,I=0.204 9,PPB=45,PPL=36.59%)。

表3 中華鱉5個居群的遺傳多樣性參數

2.3 居群遺傳分化根據Popgen 32的計算結果,居群總遺傳多樣性指數(Ht)=0.240 0±0.037 1,居群內遺傳多樣性指數(Hs)=0.174 7±0.021 6,基因分化系數(Gst)=0.271 9,基因流(Nm)=1.339 0。說明有27.19%的遺傳變異出現在居群間,有72.81%的遺傳變異出現在居群內。分子方差分析(AMOVA)結果與上述Popgen計算結果一致,結果見表4。這說明中華鱉的遺傳多樣性主要分布在居群內,各居群間表現出一定的遺傳分化水平。

表4 中華鱉5個居群的AMOVA分析

2.4 親緣關系及聚類結果由表5可知,5個居群的遺傳一致度為0.880 3～0.937 1,均值為0.910 1,雜交鱉與日本品系遺傳一致度最高;5個品系遺傳距離均值為0.943 7,雜交鱉與日本品系之間的遺傳距離最小(0.064 9),中國臺灣品系和烏鱉品系的遺傳距離最大(0.127 5)。從圖2可以看出,5個地理居群的中華鱉遺傳系數為0.89～0.94,在相似系數為0.89時,分為2個類群,在相似系數為0.93時,可分為3個類群,雜交鱉、日本品系和淮河品系聚為一類群,其中,雜交鱉與日本品系的相似系數最高,可達到達0.94。烏鱉單獨為一類群,可見烏鱉品系與其他品系的差異較大。

圖2 中華鱉5個居群的聚類分析圖

表5 中華鱉5個居群間的遺傳一致度(對角線上面)和遺傳距離(對角線下面)

3 討論

中華鱉群體的準確區分一直是育種工作的重點與難點,前人通過對不同品系中華鱉的表型特征進行區分,建立的判別函數可以作為品系區別的重要依據。陸文浩等[18]通過多元統計分析建立了判別方程,其中洪澤湖和太湖群體判別準確率可達100%,長江口群體的判別準確率達93.3%。聚類分析表明,長江口群體與太湖群體親緣關系很近,洪澤湖群體與它們的親緣關系相對較遠。當品系表型區別較大,地理差距較遠時,通過成分分析統計通常能得到較高的判別率。但當親緣關系越近,或者品系過多、群體形態相似度很高時,傳統的形態學分析方法通常難以獲得較高的判別準確率。梁宏偉等[19]建立了中華鱉3個品系的判別函數,淮河品系、黃河品系和日本品系的判別準確率分別為91.7%、75.0%和73.8%。李思發等[14]對中華鱉7個養殖群體的判別分類的準確率以黃河鱉群最高(73%),淮河鱉群和太湖鱉群較差(分別為45%、44%);聚類分析顯示,在親緣關系上太湖鱉與崇明鱉較近,黃河鱉和淮河鱉較近,洞庭湖鱉和雜交鱉較近。這表明僅通過分析體形和體表差異進行的比較研究難以保證高的判別準確率。

相比于傳統的表型特征成分分析,分子標記不依賴于動物的表型特征,而是根據遺傳信息進行區分,即使面對多個表型極其相似的品種也可以很好地將其區分開來。對中華鱉線粒體DNA中SNP位點進行基因分型和區分,共檢測到7個SNPs,可用于鑒定太湖品系、日本品系、中國臺灣品系和黃河品系[20]。Zhang等[21]對中華鱉的線粒體基因進行了擴增和酶切,建立了太湖、中國臺灣、日本和黃河4個品系中國鱉的PCR-RFLP鑒定方法。在該試驗中,雜交鱉為日本鱉和江西鱉的后代,外形最為相似,而烏鱉全身烏黑,表型與其他品系相差甚遠;聚類分析結果也表明,日本品系與雜交鱉親緣關系最近,烏鱉與其他鱉親緣關系最遠。同時個體系統發育樹的分析結果與聚類分析保持一致,且5個品系的65個個體的中華鱉都得到了準確區分,因此,使用ISSR的分析參數及試驗方法對于區分中華鱉品系有高度準確率。

除此之外,分子標記還可獲得更多的物種遺傳參數,可以反映遺傳特征、種群分化和物種間的進化關系。遺傳多樣性是生物多樣性的基本來源以及自然選擇進化的原材料,常被用來量化種群內遺傳變異性大小[13]。Xie等[22]利用RAD-seq開發中華鱉SNP標記,共鑒定了105個高質量的SNP標記。群體遺傳統計顯示,觀察雜合度(Ho)和期望雜合度值(He)分別為0.114 3～0.676 5和0.107 8～0.447 7。該試驗中5個群體He為0.139 2～0.207 4。He越高,反映群體的遺傳一致性就越低,其遺傳多樣性就越豐富。該試驗中5個居群中,烏鱉遺傳多樣性參數最高,且由聚類結果可知,烏鱉品系與其他4個品系的親緣關系也最遠。這表明烏鱉不僅形成了區別與其他品系的中華鱉穩定群體,還具備變異獲得更多優良性狀的可能。淮河鱉居群的變異程度最小,淮河鱉作為我國淮河流域的一支中華鱉地理種群,其純合體較為稀少,遺傳多樣性處于較低水平的原因可能是養殖場累代人工選育、近親繁殖的結果。另外,雜交中華鱉的遺傳特性和經濟性狀有著更加顯著的生長活力,與親本相比,雜交鱉的特異等位基因數和多態片段數增加[23],表明雜交增加了中華鱉的遺傳多樣性。

該研究中基因分化系數(Gst)=0.271 9,表明群體間存在高等的遺傳分化,分子方差分析(AMOVA)結果表明,有27%遺傳變異出現在居群,73%變異發生在居群內部,這說明該研究中華鱉群體間差異不及群體內差異,同一群體內的差異過大,遺傳多樣性高,性狀難以固定。Bu等[24]對3個地理種群(蕪湖、安徽大別山、山東聊城)的遺傳變異分析也表明,中華鱉的變異主要發生在居群內(97.4%),而不是種群間(2.6%)。基因流(Nm)是指不同種群之間基因交流的過程中,一個等位基因從一個種群進入到另一個種群,可發生在同種或不同種的生物種群之間,是維持種群內遺傳同質性和消除種群間遺傳分化的重要途徑。Feller[25]研究認為,Nm>1時,主要發揮均質化作用,即從其他種群流入的基因會阻止種群間的局部分化,該試驗中Nm為1.339 0,這可能也是中華鱉遺傳分化程度較低的原因之一。由于養鱉業的快速發展,養殖戶對各品系的雜交造成了中華鱉基因的混雜,頻繁的基因流和均質化作用使得種群間的遺傳分化程度低,該結論與AMOVA分析一致。

綜上所述,該試驗可以根據所篩選的ISSR引物以及遺傳參數分析區分5個中華鱉種群,其中烏鱉遺傳多樣性最高,雜交鱉和日本鱉親緣關系最近,群體總體的遺傳參數較為豐富,但同時也迫切需要采取保護措施來維持不同種群的遺傳穩定性。該研究結果為進一步研究中華鱉的保護生物學、系統發育和進化分析提供了基本的遺傳資料,與形態鑒定相比,大大提高了對不同品系中華鱉的鑒別能力,為中華鱉的鑒定和指導中華鱉的選育提供了進一步技術支持。