安徽六安地區(qū)1例鵝圓環(huán)病毒病PCR診斷與分析

胡曉苗,楊 雪,戴 銀*,潘孝成,王紅燕,趙瑞宏,周學(xué)利,侯宏艷,沈?qū)W懷,尹 磊,殷冬冬,魯春燕

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/安徽省畜禽疫病研究中心/畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽合肥 230031;2.宣城市動(dòng)物防疫站,安徽宣城 242000)

鵝圓環(huán)病毒(Goose circovirus,GoCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,鵝感染GoCV后,主要表現(xiàn)為免疫力低下、腹瀉、生長發(fā)育緩慢、羽毛凌亂、消瘦、精神沉郁等非特異性臨床癥狀,嚴(yán)重時(shí)會出現(xiàn)羽毛脫落和羽毛囊壞死現(xiàn)象[1]。通常情況下,鵝感染圓環(huán)病毒時(shí)多為隱形感染,感染率高但發(fā)病率、死亡率很低,往往混合感染其他病原時(shí)才被檢出。

鵝圓環(huán)病毒首次由德國學(xué)者Soike等[1]發(fā)現(xiàn),隨后Todd等最先完成GoCV全基因組測序分析[2]。2003年中國臺灣省發(fā)現(xiàn)鵝圓環(huán)病毒[3],余旭平等[4]在浙江永康朗德鵝中發(fā)現(xiàn)了鵝圓環(huán)病毒。2006年英國學(xué)者Scott等[5]利用熒光抗體檢測方法對匈牙利的一些鵝場進(jìn)行GoCV血清學(xué)調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GoCV在匈牙利鵝場普遍存在。PCR方法是GoCV常用的檢測方法,2007年楊曉偉等[6]應(yīng)用PCR方法在重慶市某鵝場檢測到鵝圓環(huán)病毒;2010年萬春和等[7]應(yīng)用PCR方法在江西省朗德鵝中檢測到GoCV;2015年張敏等[8]應(yīng)用PCR方法從山東濰坊朗德鵝體內(nèi)檢測到GoCV,曹慧慧等[9]對廣西GoCV流行毒株的全基因組進(jìn)行了測序、結(jié)果表明,廣西流行毒株與部分浙江分離毒株在親緣關(guān)系上比較接近,2017年劉玲鳳[10]對廣東水禽GoCV感染情況進(jìn)行了調(diào)查,并對GoCV全基因組序列進(jìn)行了分析;2018年吳方達(dá)[11]在福建地區(qū)一例生長消瘦鵝中PCR檢測到GoCV感染,獲取了GoCV福建株基因組全長序列;2021年沈文浩[12]對安徽部分地區(qū)GoCV感染情況進(jìn)行了調(diào)查,并對其進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析。

2022年11月中旬,安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)臨床指導(dǎo)中心接診了六安市某朗德鵝場送來的5只病死鵝,46日齡。通過觀察臨床癥狀和病理變化,初步判斷為鵝圓環(huán)病毒感染。為了進(jìn)一步確診,根據(jù)GenBank上已發(fā)表的鵝圓環(huán)病毒序列,設(shè)計(jì)了1對特異性引物,對發(fā)病鵝組織器官進(jìn)行鵝圓環(huán)病毒PCR檢測,擴(kuò)增到1株鵝圓環(huán)病毒(命名為AHLA39),并進(jìn)行序列測定和分析。

1 臨床癥狀與病理變化

1.1 臨床癥狀較為普遍的現(xiàn)象是病鵝消瘦、羽毛凌亂,背部羽毛脫落,毛孔出血;精神不振,腹瀉;鵝群采食不佳,飼料采食偏少,偏好采食青飼料(圖1)。

圖1 背部羽毛脫落、出血

1.2 病理變化病理解剖癥狀為肝臟腫大、出血;腸道出血,有大量膿性炎癥產(chǎn)物;心包積液,心內(nèi)膜少量出血(圖2、3)。

圖2 肝臟出血、心包積液

圖3 腸道出血

2 材料與方法

2.1 病料樣品無菌采集六安地區(qū)某養(yǎng)殖場發(fā)病鵝肝臟、脾臟和腎臟。

2.2 方法

2.2.1引物的設(shè)計(jì)與合成。從GenBank下載鵝圓環(huán)病毒序列,根據(jù)GenBank已經(jīng)上傳的序列進(jìn)行比對,確定上述病毒的保守區(qū)域,利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)檢測引物F:5′-ACCCTACCTTTGAAGATT-3′,R:5′-CAACCATAAAAGTCGTCC-3′,擴(kuò)增片段大小580 bp。

2.2.2DNA的提取。將病料組織剪碎,按1∶10的比例加入滅菌PBS,放入碾缽碾碎,反復(fù)凍融3次,室溫12 000 r/min離心5 min,取上清備用。按照提取試劑盒說明書提取DNA,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3PCR的反應(yīng)體系。總反應(yīng)體系25 μL:2×Taqplus Master Mix 12.5 μL,DNA模板3.0 μL,上游引物(F)1.0 μL,下游引物(R)1.0 μL,ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,48 ℃退火30 s,72 ℃延90 s,擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完成后,取上述PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,陽性PCR產(chǎn)物送上海生工生物有限公司測序。

3 PCR檢測結(jié)果

3.1 目的條帶PCR擴(kuò)增獲得的條帶是580 bp,大小與預(yù)期相符,確診為鵝圓環(huán)病毒感染。具體結(jié)果見圖4。

注:M.2 000分子量Marker;1.陽性對照;2、3.陽性樣品;4.陰性對照。

3.2 遺傳進(jìn)化分析使用MEGA 7.0將測序所得片段進(jìn)行整理拼接好,并與GenBank參考株進(jìn)行比對及構(gòu)建進(jìn)化樹(圖5),使用MegAlign進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

圖5 鵝圓環(huán)病毒遺傳進(jìn)化分析

4 討論

(1)利用MegAlign軟件對鑒定毒株與其他GoCV毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。感染毒株與山東分離株KT387277.1的遺傳距離最近,與浙江分離株yk3(DQ192280.1)、yk1(AY633653.1)以及廣東分離株MT831935.1、MT831939.1遺傳距離也比較近,與鴨源圓環(huán)病毒(DuCV)的遺傳距離較遠(yuǎn)。

(2)鵝圓環(huán)病毒常潛伏侵染鵝淋巴器官,引起免疫力下降[13],導(dǎo)致鵝常發(fā)生混合感染,病情加重,單純使用鵝圓環(huán)病毒抗體治療,效果不佳。因此,該病毒的感染直接或間接對鵝養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,是一種高感染率的免疫抑制病,應(yīng)引起各養(yǎng)殖戶的高度關(guān)注。

(3)安徽省六安市養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)比較發(fā)達(dá),皖西白鵝、朗德鵝等品種鵝飼養(yǎng)量大,鵝苗來源復(fù)雜,該病的防控顯得尤為重要。今后將持續(xù)開展該病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查,關(guān)注該病毒的流行情況,加強(qiáng)后續(xù)研究,爭取為該病毒的防治提供較為可行方案。