安徽六安地區1例鵝圓環病毒病PCR診斷與分析

胡曉苗,楊 雪,戴 銀*,潘孝成,王紅燕,趙瑞宏,周學利,侯宏艷,沈學懷,尹 磊,殷冬冬,魯春燕

(1.安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所/安徽省畜禽疫病研究中心/畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室,安徽合肥 230031;2.宣城市動物防疫站,安徽宣城 242000)

鵝圓環病毒(Goose circovirus,GoCV)屬于圓環病毒科圓環病毒屬,鵝感染GoCV后,主要表現為免疫力低下、腹瀉、生長發育緩慢、羽毛凌亂、消瘦、精神沉郁等非特異性臨床癥狀,嚴重時會出現羽毛脫落和羽毛囊壞死現象[1]。通常情況下,鵝感染圓環病毒時多為隱形感染,感染率高但發病率、死亡率很低,往往混合感染其他病原時才被檢出。

鵝圓環病毒首次由德國學者Soike等[1]發現,隨后Todd等最先完成GoCV全基因組測序分析[2]。2003年中國臺灣省發現鵝圓環病毒[3],余旭平等[4]在浙江永康朗德鵝中發現了鵝圓環病毒。2006年英國學者Scott等[5]利用熒光抗體檢測方法對匈牙利的一些鵝場進行GoCV血清學調查,結果發現GoCV在匈牙利鵝場普遍存在。PCR方法是GoCV常用的檢測方法,2007年楊曉偉等[6]應用PCR方法在重慶市某鵝場檢測到鵝圓環病毒;2010年萬春和等[7]應用PCR方法在江西省朗德鵝中檢測到GoCV;2015年張敏等[8]應用PCR方法從山東濰坊朗德鵝體內檢測到GoCV,曹慧慧等[9]對廣西GoCV流行毒株的全基因組進行了測序、結果表明,廣西流行毒株與部分浙江分離毒株在親緣關系上比較接近,2017年劉玲鳳[10]對廣東水禽GoCV感染情況進行了調查,并對GoCV全基因組序列進行了分析;2018年吳方達[11]在福建地區一例生長消瘦鵝中PCR檢測到GoCV感染,獲取了GoCV福建株基因組全長序列;2021年沈文浩[12]對安徽部分地區GoCV感染情況進行了調查,并對其進行了遺傳進化分析。

2022年11月中旬,安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所獸醫臨床指導中心接診了六安市某朗德鵝場送來的5只病死鵝,46日齡。通過觀察臨床癥狀和病理變化,初步判斷為鵝圓環病毒感染。為了進一步確診,根據GenBank上已發表的鵝圓環病毒序列,設計了1對特異性引物,對發病鵝組織器官進行鵝圓環病毒PCR檢測,擴增到1株鵝圓環病毒(命名為AHLA39),并進行序列測定和分析。

1 臨床癥狀與病理變化

1.1 臨床癥狀較為普遍的現象是病鵝消瘦、羽毛凌亂,背部羽毛脫落,毛孔出血;精神不振,腹瀉;鵝群采食不佳,飼料采食偏少,偏好采食青飼料(圖1)。

圖1 背部羽毛脫落、出血

1.2 病理變化病理解剖癥狀為肝臟腫大、出血;腸道出血,有大量膿性炎癥產物;心包積液,心內膜少量出血(圖2、3)。

圖2 肝臟出血、心包積液

圖3 腸道出血

2 材料與方法

2.1 病料樣品無菌采集六安地區某養殖場發病鵝肝臟、脾臟和腎臟。

2.2 方法

2.2.1引物的設計與合成。從GenBank下載鵝圓環病毒序列,根據GenBank已經上傳的序列進行比對,確定上述病毒的保守區域,利用引物設計軟件設計檢測引物F:5′-ACCCTACCTTTGAAGATT-3′,R:5′-CAACCATAAAAGTCGTCC-3′,擴增片段大小580 bp。

2.2.2DNA的提取。將病料組織剪碎,按1∶10的比例加入滅菌PBS,放入碾缽碾碎,反復凍融3次,室溫12 000 r/min離心5 min,取上清備用。按照提取試劑盒說明書提取DNA,-80 ℃保存備用。

2.2.3PCR的反應體系。總反應體系25 μL:2×Taqplus Master Mix 12.5 μL,DNA模板3.0 μL,上游引物(F)1.0 μL,下游引物(R)1.0 μL,ddH2O 7.5 μL。反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,48 ℃退火30 s,72 ℃延90 s,擴增35個循環;最后72 ℃延伸10 min。擴增完成后,取上述PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,陽性PCR產物送上海生工生物有限公司測序。

3 PCR檢測結果

3.1 目的條帶PCR擴增獲得的條帶是580 bp,大小與預期相符,確診為鵝圓環病毒感染。具體結果見圖4。

注:M.2 000分子量Marker;1.陽性對照;2、3.陽性樣品;4.陰性對照。

3.2 遺傳進化分析使用MEGA 7.0將測序所得片段進行整理拼接好,并與GenBank參考株進行比對及構建進化樹(圖5),使用MegAlign進行遺傳進化分析。

圖5 鵝圓環病毒遺傳進化分析

4 討論

(1)利用MegAlign軟件對鑒定毒株與其他GoCV毒株進行遺傳進化分析。感染毒株與山東分離株KT387277.1的遺傳距離最近,與浙江分離株yk3(DQ192280.1)、yk1(AY633653.1)以及廣東分離株MT831935.1、MT831939.1遺傳距離也比較近,與鴨源圓環病毒(DuCV)的遺傳距離較遠。

(2)鵝圓環病毒常潛伏侵染鵝淋巴器官,引起免疫力下降[13],導致鵝常發生混合感染,病情加重,單純使用鵝圓環病毒抗體治療,效果不佳。因此,該病毒的感染直接或間接對鵝養殖業造成巨大的經濟損失,是一種高感染率的免疫抑制病,應引起各養殖戶的高度關注。

(3)安徽省六安市養鵝產業比較發達,皖西白鵝、朗德鵝等品種鵝飼養量大,鵝苗來源復雜,該病的防控顯得尤為重要。今后將持續開展該病毒的分子流行病學調查,關注該病毒的流行情況,加強后續研究,爭取為該病毒的防治提供較為可行方案。