不同初加工方法對滇龍膽藥材品質的影響

楊 雁,金鵬程,李林玉,楊 斌,王 馨,金 航

(云南省農業科學院藥用植物研究所,云南昆明 650200)

滇龍膽(GentianarigescensFranch.)為龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬(Gentiana)多年生草本植物,以根和根莖入藥,性苦寒,歸肝膽經,具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效[1],是我國常用大宗藥材,具有悠久的藥用歷史,為歷版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《藥典》)收載的龍膽基原植物之一,是我國傳統中藥復方龍膽瀉肝丸、龍膽瀉肝片等180多種中成藥的主要原料[2]。趙志蓮等[3-4]研究表明,龍膽屬藥用植物的主要活性成分是環烯醚萜類,其中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和當藥苷是其主要藥效成分,是滇龍膽質量評價的重要指標[5-8]。產地初加工方法是影響中藥材品質形成的關鍵因素,決定了中藥材、中藥飲片及制劑的質量[9],是影響中藥臨床應用安全性和有效性的一項源頭性工序[10]。藥用植物在采收后會發生細胞縮水、破裂、變性、酶解、后熟、干燥等變化,根據藥材性質和商品銷售、運輸和保管的要求,對中藥材進行去除非藥用部位、清洗、干燥等產地初加工,防止其霉變蟲蛀,便于運輸儲存,保障中藥材質量[9]。因此科學合理的產地初加工方法至關重要。

不同的產地初加工方法直接影響藥材的質量,羅寅珠等[11]研究發現半夏藥材曬干處理后外觀性狀較好、密度高,質堅實,藥效成分含量整體較高;劉勇等[12]研究發現陰干法處理后的三七藥材質地堅實,內部結構緊密,外觀性狀較好,并且藥效成分含量較高。傳統本草記載滇龍膽藥材產地加工方法多為采后陰干[13-15],但當前滇龍膽人工種植面積較大,陰干場地和天氣原因極大地限制了滇龍膽產地加工規模化發展。近年來,已有學者開展了滇龍膽產地加工研究,吳昕怡等[16]采用熱燙的方法對滇龍膽進行加工處理,發現熱燙處理后滇龍膽中3種有效成分的OD值呈先升高后降低的趨勢;劉秀嶶等[17]研究了不同光質對滇龍膽藥材干燥品質的影響,結果顯示綠光能降低滇龍膽水分含量,并且顯著提高其龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和馬錢苷酸的含量;沈濤等[18-21]對滇龍膽適生區范圍和生物氣候特征進行研究,以期為野生滇龍膽資源保護、持續利用與產地鑒別提供依據。但此類研究多是圍繞滇龍膽資源分布、化學成分、藥理作用、產地鑒別等方面開展,有關滇龍膽產地初加工方法的研究不多,很多加工方法并未結合生產實際,推廣應用性不強,且在加工后藥材整體質量評價方面研究較少。為探索不同加工方法對滇龍膽藥材質量的影響,該研究采用9種不同的產地初加工方法,以滇龍膽的根及根莖為研究對象,測定干燥后滇龍膽樣品中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和當藥苷含量,以及總灰分、酸不溶性灰分和浸出物等指標,依據《藥典》,對樣品進行綜合評價,以期為滇龍膽產地初加工規范化研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試材。試驗用新鮮滇龍膽藥材樣品,于2021年12月采自臨滄市云縣茂蘭鎮,經云南省農業科學院藥用植物研究所金航研究員鑒定為龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬(Gentiana)植物滇龍膽(GentianarigescensFranch.)。

1.1.2儀器。ThermoFisher高效液相色譜儀UltiMate 3000系列(LPG-3400SD泵,WPS-3000SL全自動進樣器,DAD-3000紫外可見檢測器,190～900 nm);萬分之一電子分析天平(賽多利斯電子天平);TB-5200DT型超聲波清洗儀(天津市泰斯特聯創生物技術公司);101-3AB型電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特聯創生物技術公司)。

1.1.3試劑。龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和當藥苷對照品均購自上海詩丹德標準技術服務公司,批號分別為9306、9415、3456、7001。甲醇、乙腈(美國Fisher試劑公司);醋酸、磷酸(羅恩試劑公司,色譜純);水(自制超純水)。

1.2 試驗方法

1.2.1不同初加工方法。采用9種不同初加工方法對樣品進行處理,具體方法見表1。

表1 9種不同初加工方法(n=4)

1.2.2總灰分的測定。參照《藥典》(2020版)[1]龍膽灰分測定法,測定用樣品混合均勻后粉碎過100目篩,取3～5 g置熾灼至恒重的坩堝中,稱定重量(準確至0.01 g),逐漸升高溫度至500～600 ℃,待樣品完全灰化并至恒重,稱重,根據殘渣重量,計算樣品中總灰分的含量(%)。

1.2.3酸不溶性灰分的測定。取“1.2.2”項所得的灰分,加入稀鹽酸10 mL至坩堝中,坩堝用表面皿覆蓋,放置在水浴上加熱10 min,用5 mL熱水沖洗表面皿,洗液并入坩堝中,然后用無灰濾紙過濾,坩堝內的殘渣用水洗于濾紙上,并洗滌至洗液不顯氯化物反應為止。濾渣和濾紙移置同一坩堝中,干燥,熾灼至恒重。根據殘渣重量,計算樣品中酸不溶性灰分的含量(%)。

1.2.4浸出物的測定。參照《藥典》(2020版)[1]龍膽浸出物測定法(通則2201),取樣品2～4 g,精密稱定,置于 250 mL的錐形瓶中,精密加水100 mL,密塞,稱定重量,靜置1 h后,連接回流冷凝管,加熱至沸騰,并保持微沸1 h。放冷后,取下錐形瓶,密塞,再稱定重量,用水補足減少的重量,搖勻后用干燥過濾器過濾,精密量取濾液25 mL,置于已干燥至恒重的蒸發皿中,在水浴上蒸干后,于105 ℃干燥3 h,再置于干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定重量。以干燥品計算樣品中水溶性浸出物的含量(%)。

1.2.5有效成分含量的測定。

1.2.5.1色譜條件。4個有效成分的色譜柱均為Thermo液相色譜柱(AcclaimTM120A C18;250 mm×4.6 mm,5 μm);流速1.000 mL/min;進樣量10 μL;柱溫30.0 ℃。馬錢苷酸流動相為乙腈-0.1%醋酸(9∶91),檢測波長254 nm,理論塔板數不低于3 000;龍膽苦苷流動相為甲醇-水(25∶75),檢測波長270 nm,理論塔板數不低于3 000;獐牙菜苦苷流動相為甲醇-0.05%磷酸(18∶82),檢測波長237 nm,理論塔板數不低于5 000;當藥苷流動相為甲醇-水(18∶82),檢測波長247 nm,理論塔板數不低于6 000。

1.2.5.2供試品溶液制備。龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、當藥苷的制備分別參照《藥典》(2020版)秦艽、龍膽、青葉膽、當藥的含量檢測方法制備。

1.2.5.3對照品溶液制備。精密稱取對照品龍膽苦苷7 mg、馬錢苷酸8 mg、獐牙菜苦苷7 mg和當藥苷10 mg,分別用適量甲醇定容至25 mL,搖勻,4 ℃避光保存,備用。

1.2.5.4標準曲線繪制。精密量取“1.2.5.3”項下的對照品溶液各5 mL,定容至10 mL容量瓶中,連續等梯度稀釋0.5倍6次,得到不同濃度梯度對照品溶液。以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線,計算得出回歸方程,結果見表2。

表2 龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和當藥苷標準曲線

1.3 數據分析采用IBM SPSS Statistics 26軟件對4種有效成分含量以及總灰分、酸不溶性灰分和浸出物測定結果進行方差分析、聚類分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 不同干燥溫度對滇龍膽有效成分含量的影響該研究設計了7組干燥溫度、自然陰干、自然曬干共9個處理。將采收的新鮮滇龍膽按標準進行去雜質、去除非藥用部位、清洗等加工步驟,樣品混勻后隨機分組,每組試驗設置4個重復,9個處理的具體方法見表1,分析結果見表3。

表3 不同干燥溫度對滇龍膽有效成分含量的影響(n=4)

從表3可以看出,不同干燥溫度條件下,40 ℃干燥溫度條件下龍膽苦苷含量最高,平均值達9.25%,是《藥典》(2020版)規定(龍膽苦苷含量不得少于1.5%)的6.17倍,同時,測定的馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和當藥苷含量也較高;曬干的樣品龍膽苦苷含量最低,僅為5.65%,比40 ℃烘干樣品龍膽苦苷含量低3.60百分點,但曬干樣品的龍膽苦苷含量也達到了《藥典》(2020版)規定的最低標準。因此,40 ℃為滇龍膽烘干的最佳溫度,在設計不同加工方法中滇龍膽的干燥溫度選擇40 ℃。

2.2 不同加工方法對滇龍膽總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的影響滇龍膽加工過程中,總灰分、酸不溶性灰分和浸出物是《藥典》(2020版)中評價藥材質量的一個重要指標。從表4可以看出,所有免洗處理(MXYG、WMYG、WMSG、MXSG)樣品的總灰分均顯著高于水洗樣品,其中,免洗陰干(MXYG)處理樣品的總灰分最高,為9.08%,是《藥典》(2020版)規定(總灰分不得過7.0%)的1.30倍;酸不溶性灰分也是免洗處理樣品高于水洗樣品,按照《藥典》規定酸不溶性灰分不得過3.0%,免洗陰干(MXYG)處理樣品的酸不溶性灰分最高,為5.52%,是《藥典》(2020版)規定的1.84倍;免洗陰干(MXYG)和微波免洗陰干(WMYG)處理樣品的浸出物顯著低于其他處理,按照《藥典》(2020版)規定的水溶性浸出物不得少于36.0%,免洗陰干(32.40%)和微波免洗陰干(28.17%)處理后的樣品達不到《藥典》(2020版)標準。水洗烘干(SXHG)處理樣品的總灰分、酸不溶性灰分和浸出物均達到了《藥典》(2020版)標準。

表4 不同初加工方法對總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的影響(n=4)

2.3 不同加工方法對滇龍膽中4種有效成分含量的影響從表5可以看出,不同加工處理方法滇龍膽中4種有效成分含量有一定差異。其中,水洗烘干(SXHG)處理滇龍膽的龍膽苦苷含量最高,為9.25%,是《藥典》(2020版)規定(龍膽苦苷含量不得少于1.5%)的6.17倍,免洗微波處理1 min后曬干(WMSG)樣品的龍膽苦苷含量最低(4.62%),是《藥典》(2020版)標準的3.08倍;水洗烘干(SXHG)處理滇龍膽的馬錢苷酸含量也顯著高于其他處理;同時,水洗烘干處理的干燥時間最短,僅為12 h,遠低于其他處理。

表5 不同初加工方法對滇龍膽有效成分含量的影響(n=4)

2.4 聚類分析對9種不同加工方法處理的36批(n=4)滇龍膽樣品進行聚類分析,結果見圖1。由圖1可知,當臨界值在5時,可將加工方法分為4大類,其中,WSYG、SXYG、MXYG處理樣品劃分為第1類,此類樣品龍膽苦苷含量相近;SXHG處理樣品單獨劃分為第2類,此類樣品龍膽苦苷含量最高;WMSG處理樣品劃分為第3類,此類樣品龍膽苦苷含量最低;WMYG、WSSG、MXSG和SXSG處理樣品劃分為第4類,此類樣品龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、馬錢苷酸和當藥苷含量相近。當臨界值在10時,可將加工方法分為2大類,其中,WSYG、SXYG、MXYG和SXHG處理樣品劃分為第1類,此類樣品龍膽苦苷含量均在7.0%以上,顯著高于其他樣品,除前處理方法不同外,加工方法以陰干為主;WMSG、WSSG、SXSG、MXSG和WMYG處理樣品劃分為第2類,此類樣品龍膽苦苷含量低于6.5%,加工方法以曬干為主。

圖1 不同加工方法滇龍膽樣品聚類分析樹狀圖

2.5 主成分分析用SPSS 26.0對9種不同加工方法處理的36批(n=4)滇龍膽樣品中龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷和當藥苷含量進行主成分分析。由表6可知,以特征值大于1為提取標準,得到2個主成分(PCA1和PCA2)。PCA1的特征值為1.779,其貢獻率最大,方差貢獻率為44.464%,由成分的載荷矩陣(表7)可知,龍膽苦苷在主成分1上的載荷值最高,對主成分1貢獻較大。PCA2的特征值為1.070,其總方差貢獻率為26.746%。前2個主成分的累計方差貢獻率達到71.210%,表達全部信息的71.210%。

表6 主成分的特征根及貢獻率

表7 成分載荷矩陣

通過SPSS軟件處理后得出主成分得分系數(表8),第一主成分貢獻最大,其中第一主成分中系數最大的為龍膽苦苷,說明龍膽苦苷在滇龍膽的質量控制中起著重要作用。根據主成分計算公式和主成分得分系數可以算出前2個主成分與4種有效成分的線性組合為:

表8 主成分得分系數

F1=0.588X1+ 0.502X2-0.164X3+0.058X4

F2=-0.175X1+0.113X2+0.759X3+0.500X4

計算主成分綜合得分及排序(表9)。由綜合得分可知,不同加工方法滇龍膽樣品中以水洗烘干(SXHG)綜合質量最好;免洗陰干(MXYG)綜合質量次之,但該方法加工的樣品總灰分和浸出物未達到《藥典》標準;水洗陰干(SXYG)在傳統生產中農戶廣泛使用,可根據天氣、場地等實際情況在產地加工中作為輔助干燥方法。

表9 不同加工方法滇龍膽藥材的主成分因子及品質綜合評價

3 討論

中藥材經產地加工后不僅便于藥材的運輸和儲藏,而且不同的產地加工方法對藥材品質也有極大影響。中藥材產地初加工方法的選擇和形成通常是基于原產地習用方法、操作簡單、技術要求低、投入較少等原則[12],因此,該研究比較了9種不同產地初加工方法,通過綜合評價,結果表明不同產地初加工方法對滇龍膽藥材品質有較大影響。傳統的免洗陰干和曬干雖然也能較好地保證藥材原有性狀,干燥成本低,但其耗時較久,所需干燥場地大,受天氣等因素影響較大,藥材容易發生霉變[22-23],而且未經水洗的藥材總灰分、酸不溶性灰分較高,水溶性浸出物較低,未能達到《藥典》(2020版)規定標準,因此探索替代傳統干燥方法的新技術、新方法成為滇龍膽產地加工的重要任務。

該研究通過選取不同的滇龍膽初加工方法,研究結果發現滇龍膽經水洗后新鮮藥材表面的灰塵和雜質都大大減少,藥材的外觀形態和色澤較未洗過的更佳,并且總灰分、酸不溶性灰分和浸出物均能達到《藥典》標準;從有效成分含量測定的結果可以看出,40 ℃烘干能較好地保留滇龍膽中的苷類成分,結合主成分綜合評價得分結果、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物等指標比較,可知水洗后40 ℃烘干相對來說接近于傳統干燥方法,干燥后的樣品外觀性狀好,操作簡單,干燥時間短,并且所得樣品有效成分含量也較其他加工方法最高。

4 結論

綜上所述,滇龍膽新鮮藥材經流水沖洗2 min,然后放入40 ℃烘箱烘干(即水洗烘干)是滇龍膽產地加工的適宜方法,若藥材加工量較大,可根據天氣、場地等實際情況采用水洗陰干方法進行加工。