懷菊花總黃酮富集純化工藝優(yōu)化及其抗炎活性、成分組成研究

鄧曉顏王小蘭李 孟張 莉李玉賢*鄭曉珂馮衛(wèi)生

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省中藥開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046）

懷菊花為菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭狀花序，具有清熱解毒、清肝明目功效，為河南道地藥材四大懷藥之一［1］。課題組前期對(duì)懷菊花及其莖葉化學(xué)成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)大量黃酮類(lèi)化合物［2-3］，并對(duì)其抗炎活性進(jìn)行篩選［4-5］。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，其有效部位是發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，故如何富集以增強(qiáng)臨床療效是相關(guān)研究的關(guān)鍵［6］。黃酮作為懷菊花主要成分，具有抗氧化［7］、降血壓［8］作用，并且菊花清熱解毒功效與抗炎作用有一定相關(guān)性［9］，活性成分主要為黃酮［10］，故對(duì)其富集純化有助于挖掘藥材更多藥用價(jià)值。

目前，關(guān)于懷菊花總黃酮的研究主要集中在提取工藝、含量測(cè)定方面［11-12］，鮮有涉及純化方面。因此，本實(shí)驗(yàn)采用AB-8 型大孔吸附樹(shù)脂［13］對(duì)懷菊花總黃酮進(jìn)行富集純化，響應(yīng)面法優(yōu)化工藝，并通過(guò)氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL） 誘導(dǎo)的HUVECs增殖細(xì)胞模型來(lái)評(píng)價(jià)抗炎活性，HPLC 法來(lái)分析成分組成，以期為綜合開(kāi)發(fā)該成分提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 DZTW 型調(diào)溫電熱套（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；NVP-1000 型隔膜真空泵、OSB-2000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、A-1000S 型水流抽氣機(jī)、FDU-2110 型冷凍干燥機(jī)、CA-1116A 型冷卻水循環(huán)裝置（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；SHH.W21.420型智能恒溫水箱（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）；EVOLUTION300 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；BSA224S 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］；Forma 3111 細(xì)胞培養(yǎng)箱 （美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；TS100 倒置顯微鏡 （日本Nikon 公司）；Milli-Q Advantage A10 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；Centrifuge-5804R小型高速低溫冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 試劑與藥物 蘆丁對(duì)照品（批號(hào)B20771，上海源葉生物科技有限公司）。亞硝酸鈉、硝酸鋁（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；氫氧化鈉（成都市科隆化學(xué)品有限公司）。AB-8 型吸附樹(shù)脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）。ox-LDL （批號(hào)YB-002-1，廣州奕源生物科技有限公司）；IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒 （批號(hào)KE00021，KE00139，KE00154，武漢三鷹生物科技有限公司）；CCK-8 （批號(hào)CA1210）、青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液（批號(hào)P1410） （北京索萊寶科技有限公司）；DMEM （批號(hào)2338234，美國(guó)Gibco 公司）；胎牛血清（批號(hào)20010502，杭州四季青生物工程研究所）。其他試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院李強(qiáng)老師惠贈(zèng)。

1.4 藥材 懷菊花購(gòu)自河南綠禾藥業(yè)有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定為菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat 的干燥頭狀花序。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定

2.1.1 粗提物制備 參考文獻(xiàn)［14］ 報(bào)道，稱取藥材20 g，以料液比1 ∶25 加入70%乙醇500 mL，加熱回流提取2 次，每次2 h，合并提取液，減壓回收乙醇，濃縮液冷凍干燥，即得，提取率為55.2%。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取蘆丁對(duì)照品5 mg，70%乙醇溶解并定容至25 mL 量瓶中，分別精密量取0.5、1.5、2.5、3.5、5.5、7.5 mL 至25 mL 量瓶中，依次加入顯色劑亞硝酸鈉、硝酸鋁后定容，以70%乙醇為空白對(duì)照，在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo) （A） 進(jìn)行回歸，得方程為A＝11.621X+0.003 3 （r＝0.999 0），在0.004 0～0.060 0 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 測(cè)定方法 精密量取“2.1.1” 項(xiàng)下濃縮液2.5 mL 至25 mL 量瓶中，70%乙醇超聲溶解并定容，得到樣品溶液，量取10 mL 至25 mL 量瓶中，按“2.1.2” 項(xiàng)下方法顯色，測(cè)得總黃酮含量為14.015 mg／mL。

2.2 純化工藝優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法。

2.2.1 大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理 參考文獻(xiàn)［15］ 報(bào)道，采用95%乙醇浸泡樹(shù)脂24 h 以上，充分溶脹后將漂浮雜質(zhì)除去，濕法裝柱，95%乙醇沖柱至沖洗液無(wú)白色混濁，大量蒸餾水沖洗至無(wú)醇味。

2.2.3 單因素試驗(yàn) 以上樣質(zhì)量濃度、上樣液pH值、上樣量、乙醇解吸體積分?jǐn)?shù)、水除雜體積、乙醇解吸體積為影響因素，考察它們對(duì)純化工藝的影響。（1） 上樣質(zhì)量濃度，稱取6 份預(yù)先處理好的AB-8 型樹(shù)脂10 g，濕法裝柱，70%乙醇將濃縮液稀釋定容為含總黃酮0.12、0.36、0.56、0.67、0.83、1.46 mg／mL 的上樣液各25 mL，分別量取7 mL上樣，收集流出液；（2） 上樣液pH 值，分別配制pH 值為2、3、4、5、6、8 的0.56 mg／mL 總黃酮溶液，上樣，收集流出液；（3） 上樣量，配制pH 值為4 的0.56 mg／mL 總黃酮溶液，上樣2 BV，分別在0.4、0.8、1.2、1.6、2 BV 收集過(guò)柱液；（4） 乙醇解吸體積分?jǐn)?shù)，配制pH 值為4 的0.56 mg／mL 總黃酮溶液，上樣0.9 BV，4 BV 蒸餾水除雜，分別用70%、80%、90%、95% 乙醇各2 BV 解吸，收集解吸液；（5） 水除雜體積，配制pH 值為4 的0.56 mg／mL 總黃酮溶液，上樣，分別用2、3、4、5、6 BV 蒸餾水除雜，2 BV 80%乙醇解吸，收集解吸液；（6） 乙醇解吸體積，配制pH 值為4 的0.56 mg／mL 總黃酮溶液，上樣，4 BV蒸餾水除雜，分別用0.5、1、2、3、4 BV 80%乙醇解吸，收集解吸液，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig．1 Results of single factor tests

由此可知，吸附率、解吸率都隨著各影響因素增加先升后降，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度為0.56 mg／mL，pH 值為4 時(shí)，樹(shù)脂吸附飽和，吸附率達(dá)到最大。前期報(bào)道，當(dāng)流出液中總黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到上樣液體積分?jǐn)?shù)的10%時(shí)，即達(dá)到泄漏點(diǎn)［16］，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上樣1.2 BV 時(shí)已超過(guò)泄漏點(diǎn)，故選取接近泄漏點(diǎn)的0.9 BV 作為最優(yōu)上樣量。另外，用4 BV水除雜，2 BV 80%乙醇解吸時(shí)，總黃酮解吸完全并不被稀釋，解吸率達(dá)到最大。最終，分別選擇80%、2 BV、4 BV 作為乙醇解吸體積分?jǐn)?shù)、乙醇解吸體積、水除雜體積的響應(yīng)面中心點(diǎn)。

2.2.4 Box-Behnken 響應(yīng)面法 結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇解吸體積分?jǐn)?shù)（A）、乙醇解吸體積（B）、水除雜體積（C） 作為影響因素，解吸率（Y） 作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，具體見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平Tab．1 Factors and levels

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab．2 Design and results of tests

采用Design-Expert 11.0 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，得方程為Y＝84.93+2.88A+10.26B+ 2.31C-0.256 3AB-3.28AC+ 4.34BC-12.86A2-20.56B2-5.74C2，結(jié)果見(jiàn)表3。由此可知，模型P＜0.01，具有高度顯著性；失擬項(xiàng)P＞0.05，表明是由隨機(jī)誤差引起的殘差［17］；確定系數(shù)R2＝0.933 2，AdjustedR2＝0.847 3，表明模型擬合程度較好，響應(yīng)值變化有84.73%來(lái)源于影響因素；因素B、A2、B2有極顯著影響（P＜0.01）；各因素影響程度依次為B＞A＞C。

表3 方差分析Tab．3 Analysis of variance

響應(yīng)面分析見(jiàn)圖2［18-19］。由此可知，因素B對(duì)解吸率的影響最大，A次之，C最小，與表2 結(jié)果一致；各因素交互項(xiàng)影響程度依次為BC＞AC＞AB。

圖2 各因素響應(yīng)面圖Fig．2 Response surface plots for various factors

2.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“2.2.4” 項(xiàng)下結(jié)果，得到最優(yōu)純化工藝為乙醇解吸體積分?jǐn)?shù)80.73%，乙醇解吸體積2.28 BV，水除雜體積4.28 BV，考慮到實(shí)際可操作性，將其調(diào)整為乙醇解吸體積分?jǐn)?shù)80%，乙醇解吸體積2 BV，水除雜體積4 BV。按優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得平均解吸率為84.93%，與預(yù)測(cè)值86.80%接近；純化前總黃酮純度為11.74%，而純化后升至52.71%，表明該工藝穩(wěn)定可靠。

2.3 抗炎活性研究

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及給藥 HUVECs 細(xì)胞復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)定溫度為37 ℃ （含5% CO2），分為對(duì)照組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h）、ox-LDL 組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，150 μg／mL ox-LDL 處理24 h）、給藥組（500 μg／mL 總提物及25、50、100 μg／mL總黃酮含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后，150 μg／mL ox-LDL 處理24 h），每組6 個(gè)復(fù)孔。

2.3.2 總黃酮對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將HUVECs 細(xì)胞懸液接種于96 孔板（密度4.0×104／孔），細(xì)胞貼壁后更換無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 使其生長(zhǎng)同步化，分組并給藥24 h 后取上清液，加入100 μL新鮮培養(yǎng)基，再加入10 μL CCK-8 孵育4 h，在全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀540 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖率［20］，公式為增殖率＝（實(shí)驗(yàn)組吸光度／對(duì)照組吸光度） ×100%，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，與對(duì)照組比較，ox-LDL 組細(xì)胞增殖率降低（P＜0.01）；與ox-LDL 組比較，總提物、總黃酮組細(xì)胞增殖率升高（P＜0.05，P＜0.01），并且總黃酮組呈一定劑量依賴性。

圖3 懷菊花總黃酮對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)HUVECs 細(xì)胞增殖率的影響Fig．3 Effect of total flavonoids from Huai Chrysanthemum on proliferation rate of HUVECs cells induced by ox-LDL

2.3.3 總黃酮對(duì)炎癥因子水平的影響 將“2.3.2”項(xiàng)下細(xì)胞上清液在4 ℃下離心5 min 后，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-1β （圖4A）、IL-6（圖4B）、TNF-α （圖4C） 水平，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，與對(duì)照組比較，ox-LDL 組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；與ox-LDL組比較，總提物、100 μg／mL 總黃酮組IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），總提物、不同劑量總黃酮組TNF-α 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 懷菊花總黃酮對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)HUVECs 細(xì)胞炎癥因子水平的影響Fig．4 Effects of total flavonoids from Huai Chrysanthemum on inflammatory factor levels in HUVECs cells induced by ox-LDL

2.4 成分組成分析 采用HPLC 法。

2.4.1 色譜條件 Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈 （A）-0.2% 磷酸（B），梯度洗脫 （0～5 min，11%～16% A；5～15 min，16%A；15～18 min，16%～19%A；18～30 min，19%A；30～35 min，19%～22% A；35～55 min，22%A；55～57 min，22%～28% A；57～70 min，28%A；70～95 min，28%～80%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.4.2 對(duì)照品溶液制備 取各對(duì)照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇超聲溶解，定容，制成分別含101 μg／mL 木犀草苷、201 μg／mL 異綠原酸A、107 μg／mL 芹菜素-7-O-葡萄糖苷、759.05 μg／mL香葉木素-7-O-葡萄糖苷、796 μg／mL 木犀草素、663.48 μg／mL 金合歡素-7-O-葡萄糖苷、832 μg／mL芹菜素、762 μg／mL 香葉木素、855 μg／mL 金合歡素的貯備液，分別取0.5 mL，甲醇稀釋1 倍，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.4.3 供試品溶液制備 取純化后的總黃酮凍干粉約1 mg，置于錐形瓶中，加1 mL 甲醇溶解，搖勻，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.4.4 結(jié)果分析 取對(duì)照品、供試品溶液適量，在“2.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，通過(guò)比對(duì)色譜峰保留時(shí)間、紫外最大吸收波長(zhǎng)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)確認(rèn)成分，結(jié)果見(jiàn)圖5，共發(fā)現(xiàn)9 種成分，包括8 種黃酮、1 種有機(jī)酸，分別為木犀草苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、香葉木素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素、金合歡素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素、香葉木素、金合歡素、異綠原酸A。

圖5 各成分HPLC 色譜圖Fig．5 HPLC chromatograms of various constituents

3 討論與結(jié)論

在純化工藝中，上樣液濃度大、黏性增加、雜質(zhì)增多、pH 過(guò)高或過(guò)低均會(huì)造成黃酮存在形式發(fā)生變化，從而影響大孔吸附樹(shù)脂吸附，并且在除雜、解吸時(shí)其用量過(guò)大也會(huì)將吸附上的黃酮解吸下來(lái)而造成損失。純化前，懷菊花總提物凍干粉呈偏黑褐色，易吸潮而變黏稠；純化后，它呈偏黃棕色，吸濕性降低，總黃酮純度明顯提高。

在前期研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用ox-LDL 誘導(dǎo)HUVECs 細(xì)胞損傷模型，評(píng)價(jià)懷菊花總提物及其總黃酮對(duì)HUVECs 細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，總黃酮可通過(guò)降低細(xì)胞炎性因子分泌來(lái)保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，具有潛在的抗動(dòng)脈粥樣硬化活性，但其藥效和作用機(jī)制還有待通過(guò)體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步研究。

目前，關(guān)于懷菊花所含成分含量測(cè)定的報(bào)道大多只涉及2020 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定的3 種指標(biāo)成分［21］（綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸），僅王月茹［22］測(cè)定了其他5 種黃酮含量。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法指認(rèn)了懷菊花總黃酮中8 種黃酮、1 種有機(jī)酸，數(shù)量多于目前相關(guān)文獻(xiàn)所發(fā)表，可為該藥材開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)，具有一定實(shí)際意義。