靈芝三萜真空耦合超聲提取工藝優(yōu)化及其抗帕金森病活性

吳淑珍，王 成，桂雙英，彭 燦，羅建平，李強(qiáng)明*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)，安徽 合肥 240603；2.霍山縣天下澤雨生物科技發(fā)展有限公司，安徽 六安 237200；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012）

靈芝作為傳統(tǒng)名貴中藥，具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘、延年益壽等功效［1-3］，靈芝三萜是其主要活性成分之一，有著護(hù)肝、抗病毒、抗腫瘤等活性，開發(fā)前景廣泛［4-5］，目前其提取方法主要有熱回流提?。?］、超聲提?。?］、超臨界提?。?］、酶提?。?］等，但存在溫度高、時(shí)間長、操作繁瑣、成本高昂等缺點(diǎn)。真空耦合超聲提取是在真空條件下對(duì)中藥活性成分進(jìn)行超聲提取的方法，其中真空通過降低溶劑沸點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)低溫高效提取，而超聲通過空化效應(yīng)來加速活性成分溶出［10］，其省時(shí)、省力、高效，但尚未應(yīng)用于靈芝三萜的提取。因此，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化靈芝三萜真空耦合超聲提取工藝。

帕金森病是以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡為病理特征，靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直等為臨床表現(xiàn)的第二大神經(jīng)退行性疾病，目前臨床上仍主要以左旋多巴等藥物進(jìn)行對(duì)癥治療，但不能挽救多巴胺能神經(jīng)元變性死亡，故發(fā)掘相關(guān)中藥活性成分具有重要意義［11］。根據(jù)靈芝傳統(tǒng)功效，課題組前期推測(cè)靈芝三萜可能具有抗帕金森病活性，但未見相關(guān)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠帕金森病模型來對(duì)此進(jìn)行研究。

1 材料

1.1 試劑與藥物 齊墩果酸對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%）。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP） （上海碧云天生物技術(shù)有限公司，純度≥98%）。乙醇、左旋多巴、冰醋酸、氯化鈉、CMC-Na、蒸餾水、高氯酸、水合氯醛、多聚甲醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器 AL104 電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］；V-5000 可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；HH-1 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）；KQ-300DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；GM-0.33A 隔膜真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KW-6C 疲勞轉(zhuǎn)棒儀（南京卡爾文生物科技有限公司）。

1.3 藥材 靈芝子實(shí)體購自霍山縣天下澤雨生物科技發(fā)展有限公司，經(jīng)合肥工業(yè)大學(xué)羅建平教授鑒定為正品。

1.4 動(dòng)物 SPF 級(jí)C57BL／6 雄性小鼠，6～8 周齡，體質(zhì)量20～25 g，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK （豫）2020-0005。

2 方法

2.1 靈芝三萜含量、得率測(cè)定

2.1.1 線性關(guān)系考察 參考文獻(xiàn)［9］ 報(bào)道，以齊墩果酸為對(duì)照品，在546 nm 波長處測(cè)定吸光度，以其為縱坐標(biāo)（A），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，得方程為A＝58.225X-0.047 3 （R2＝0.995 0）。

2.1.2 測(cè)定方法 精密量取供試品溶液0.2 mL，置于10 mL 離心管中，按“2.1.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算含量。再測(cè)定該成分得率，公式為得率＝（CV／M） ×100%，其中C為供試品溶液質(zhì)量濃度，V為濾液體積，M為靈芝子實(shí)體粉末質(zhì)量。

2.2 單因素試驗(yàn) 將靈芝子實(shí)體粉碎10 min 后過200 目篩，得到超微粉，置于60 ℃烘箱中干燥至恒重，精密稱取1 g 至具塞錐形瓶中，加入90%乙醇30 mL，設(shè)定超聲功率為240 W，開啟真空泵形成負(fù)壓，通過二通閥調(diào)節(jié)真空度為0.08 MPa，在30 ℃下超聲提取，分別考察不同超聲時(shí)間（5、10、20、40、80 min）、超聲溫度 （20、30、40、50、60 ℃）、乙醇體積分?jǐn)?shù) （70%、80%、90%、95%、100%）、料液比（1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶ 50）、超聲功率 （150、180、240、270、300 W） 對(duì)靈芝三萜得率的影響。

2.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）、料液比 （D） 進(jìn)行四因素三水平設(shè)計(jì)，具體見表1。

表1 因素水平Tab．1 Factors and levels

2.4 抗帕金森病活性研究

2.4.1 靈芝三萜制備 將優(yōu)化工藝所得的靈芝三萜按照文獻(xiàn)［12］ 報(bào)道進(jìn)行純化，先用氯仿萃取濃縮，再用相同體積的飽和NaHCO3溶液提取4次，鹽酸調(diào)節(jié)pH 至3～4，將沉淀溶于氯仿中減壓干燥，測(cè)得得率為0.38%。

2.4.2 分組、造模及給藥 參考文獻(xiàn)［13］ 報(bào)道，50 只小鼠隨機(jī)均分為正常組、模型組、陽性藥組（L-多巴胺，75 mg／kg）、靈芝三萜高劑量組（200 mg／kg）、靈芝三萜低劑量組（100 mg／kg），陽性藥組、靈芝三萜各劑量組小鼠均連續(xù)灌胃給藥14 d。從給藥第4 天開始，模型組、陽性藥組、靈芝三萜各劑量組小鼠均腹腔注射MPTP（30 mg／kg），連續(xù)7 d，正常組小鼠灌胃給予生理鹽水。

2.4.3 行為學(xué)測(cè)試

2.4.3.1 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn) 將小鼠依次放置在轉(zhuǎn)棒儀上，設(shè)定轉(zhuǎn)速為40 r／min，記錄從登棒到掉棒的時(shí)間，從造模前3 d 開始訓(xùn)練，每天1 次。末次給藥后，每只小鼠進(jìn)行3 次測(cè)試，取平均值。

2.4.3.2 懸掛實(shí)驗(yàn) 將小鼠前爪掛在直徑5 mm的玻璃棒上（為了防止其趴在玻璃棒上，用透明塑料板將頂部蓋住），記錄抓住玻璃棒的時(shí)間，從造模前3 d 開始懸掛訓(xùn)練，每天3 次。末次給藥后，每只小鼠進(jìn)行3 次測(cè)試，取平均值。

2.4.4 腦組織指標(biāo)檢測(cè)

2.4.4.1 黑質(zhì)致密部Nissl 染色 處死小鼠，取腦組織黑質(zhì)致密部，石蠟包埋后進(jìn)行切片，按照Nissl 試劑盒操作步驟進(jìn)行染色，最后封片并進(jìn)行拍照。

2.4.4.2 黑質(zhì)致密部、紋狀體酪氨酸羥化酶（TH） 免疫組織化學(xué) 處死小鼠，取腦組織黑質(zhì)致密部、紋狀體部位，石蠟包埋后進(jìn)行切片，按照免疫組織化學(xué)步驟進(jìn)行操作，統(tǒng)計(jì)TH 免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元情況［14］。

2.5 圖像分析 參考文獻(xiàn)［14-16］ 報(bào)道，采用Image-pro Plus 軟件統(tǒng)計(jì)小鼠腦組織中神經(jīng)元數(shù)量。

2.6 數(shù)據(jù)分析 通過GraphPad Prism 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，one-way ANOVN 單因素方差分析、多重比較分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以（±s） 表示。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 超聲時(shí)間 圖1 顯示，靈芝三萜得率隨著超聲提取時(shí)間延長先升高，可能是由于超聲波空化效應(yīng)破壞了細(xì)胞壁，促使該成分溶出，在40 min時(shí)最高；40 min 后其得率反而降低，可能與不斷超聲會(huì)破壞結(jié)構(gòu)成分有關(guān)［17］。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)靈芝三萜得率的影響Fig．1 Effect of ultrasonic time on yield of Ganoderma lucidum triterpenoids

3.1.2 超聲溫度 圖2 顯示，靈芝三萜得率隨著超聲溫度增加先升高，表明高溫會(huì)加快分子運(yùn)動(dòng)速度，促進(jìn)該成分浸出，在50 ℃時(shí)最高；50 ℃后其得率反而降低，可能與溫度過高會(huì)破壞結(jié)構(gòu)成分有關(guān)。

圖2 超聲溫度對(duì)靈芝三萜得率的影響Fig．2 Effect of ultrasonic temperature on yield of Ganoderma lucidum triterpenoids

3.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù) 圖3 顯示，靈芝三萜得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加先升高，在90% 時(shí)最高；之后其得率反而降低，可能與醇類成分溶出增加會(huì)導(dǎo)致三萜類成分溶出減少有關(guān)［18］。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)靈芝三萜得率的影響Fig．3 Effect of ethanol concentration on yield of Ganoderma lucidum triterpenoids

3.1.4 料液比 圖4 顯示，靈芝三萜得率隨著料液比增加先升高后趨于平穩(wěn)，在1 ∶20 時(shí)最高，可能是因?yàn)槠鋫髻|(zhì)過程有所加快［19］。

圖4 料液比對(duì)靈芝三萜得率的影響Fig．4 Effect of solid-liquid ratio on yield of Ganoderma lucidum triterpenoids

3.1.5 超聲功率 圖5 顯示，靈芝三萜得率隨著超聲功率增加先升高，在240 W 時(shí)最高；240 W 后其得率反而降低，可能與溶液分子運(yùn)動(dòng)加劇有關(guān)［20］。

圖5 超聲功率對(duì)靈芝三萜得率的影響Fig．5 Effect of ultrasonic power on yield of Ganoderma lucidum triterpenoids

3.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以靈芝三萜得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34） 表進(jìn)行設(shè)計(jì)，結(jié)果見表2。由此可知，提取時(shí)間影響程度最大，料液比影響程度最??；最優(yōu)工藝為A3B3C3D2，即超聲時(shí)間60 min，超聲溫度60 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，料液比1 ∶20。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab．2 Design and results of tests

3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)、對(duì)比試驗(yàn) 對(duì)“3.2” 項(xiàng)下工藝進(jìn)行5 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得靈芝三萜平均得率為0.887%，大于表2 最大值，表明該工藝穩(wěn)定可靠。再參照文獻(xiàn) ［21］ 報(bào)道進(jìn)行提取，即超聲時(shí)間40 min，超聲溫度30 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)90%，料液比1 ∶30，測(cè)得靈芝三萜平均得率為0.551%，而驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與其相比提高了60.98%，進(jìn)一步印證了真空耦合超聲提取的優(yōu)越性。

3.4 行為學(xué)檢測(cè) 如圖6A 所示，與模型組比較，靈芝三萜各劑量組小鼠轉(zhuǎn)棒時(shí)間延長（P＜0.05）。如圖6 所示，與模型組比較，靈芝三萜各劑量組小鼠懸掛時(shí)間延長（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 小鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果Fig．6 Results of mouse behavioral detection

3.5 腦組織檢測(cè) 如圖7A 所示，模型組小鼠黑質(zhì)致密部Nissl 陽性細(xì)胞數(shù)少于正常組（P＜0.05），而靈芝三萜各劑量組小鼠其數(shù)量多于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。如圖7B 所示，模型組小鼠黑質(zhì)致密部TH 陽性細(xì)胞數(shù)少于正常組（P＜0.01），而靈芝三萜各劑量組小鼠其數(shù)量多于模型組（P＜0.01）。如圖7C 所示，模型組小鼠紋狀體TH 陽性纖維數(shù)少于正常組（P＜0.01），而靈芝三萜各劑量組小鼠其數(shù)量多于模型組（P＜0.01）。

圖7 小鼠腦組織檢測(cè)結(jié)果Fig．7 Results of mouse brain tissue detection

4 討論與結(jié)論

前期報(bào)道，李顏桃等［10］采用真空耦合超聲提取沙棘籽多酚，操作簡(jiǎn)便，得率較高；田莉等［22］通過該方法提取蘋果渣多酚，時(shí)間縮短，得率提高。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，靈芝三萜以該方法提取后得率較前期方法增加60.98%，進(jìn)一步印證了其優(yōu)越性。

研究表明，靈芝三萜具有多種生物活性，Yu等［23］證明它可改善小鼠認(rèn)知障礙，減輕神經(jīng)元損傷，從而改善阿爾茨海默癥；俞盈等［24］通過睡眠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，靈芝三萜酸可有效改善睡眠，但目前還未見該成分抗帕金森病的研究。本實(shí)驗(yàn)采用MPTP誘導(dǎo)的小鼠帕金森病模型來評(píng)價(jià)靈芝三萜抗帕金森病活性，發(fā)現(xiàn)該成分可顯著改善多巴胺能神經(jīng)元缺失、運(yùn)動(dòng)功能障礙，能為后續(xù)相關(guān)藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)，但其分子機(jī)制尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。