UPLC 法同時測定養陰清肺丸中7 種成分

袁 航，尹麗華，陳安珍，殷世寧，吳愛英，盧京光

（青島市食品藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局海洋中藥質量研究與評價重點實驗室，山東 青島 266071）

養陰清肺丸由地黃、麥冬、玄參、川貝母、白芍、牡丹皮、甘草、薄荷8 味藥材組成，具有養陰潤燥、清肺利咽的功效，臨床上用于治療陰虛肺燥、咽喉干痛、干咳少痰或痰中帶血，現收載于2020 年版《中國藥典》 一部，有大蜜丸、小蜜丸、水蜜丸、水丸4 種規格［1］，但僅對丹皮酚進行控制，而且目前相關文獻也僅涉及芍藥苷［2-4］。中藥復方制劑藥味眾多，組成復雜，僅以單一成分為指標無法實現全面客觀評價其質量的目的［5-7］，故本實驗采用UPLC 法同時測定養陰清肺丸中哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸的含量，以期為提高該制劑質量控制標準提供理論依據、技術支撐。

1 材料

Agilent 1290 Infinity 快速高分離液相色譜儀（美國Agilent 公司）；ME204T／02 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AS10200BT 型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。哈巴苷（批號111729-201707，純度96.8%）、芍藥苷（批號110736-201943，純度 100%）、甘草苷 （批號111610-201908，純度95.0%）、毛蕊花糖苷（批號111530-201914，純度95.2%）、哈巴俄苷 （批號111730-201709，純度95.9%）、丹皮酚 （批號110708-201407，純度99.9%）、甘草酸銨 （批號110731-201720，純度97.7%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。養陰清肺丸共96 批，由14個廠家生產，其中3 個廠家生產水蜜丸，共46 批；12 個廠家生產大蜜丸，共46 批；1 個廠家生產小蜜丸，共3 批；1 個廠家生產水丸，共1 批（由于1 個廠家同時生產大蜜丸、水蜜丸，1 個廠家同時生產大蜜丸、水丸，1 個廠家同時生產大蜜丸、小蜜丸，故有交叉現象）。乙腈為色譜純 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）；其余試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件、系統適用性考察 Agilent SB-C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm），以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫 （0～3 min，3% A；3～16 min，3%～16%A；16～20 min，16%A；20～26 min，16%～25% A；26～31 min，25%～30% A；31～33 min，30%～37%A；33～38 min，37%～42%A；38～40 min，42%～45%A；40～45 min，45%～100%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm （0～8 min，哈巴苷）、230 nm （8～18 min，芍藥苷）、278 nm （18～21 min，甘草苷）、332 nm （21～27 min，毛蕊花糖苷）、278 nm（27～33 min，哈巴俄苷、丹皮酚）、252 nm （33～45 min，甘草酸銨）；進樣量4 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸銨對照品適量，70%甲醇制成每1 mL 分別含435、883.75、255、135、146、1 036.67、711 μg 上述成分的貯備液，分別精密吸取適量，70%甲醇制成適宜質量濃度，即得（甘草酸含量＝甘草酸銨含量／1.020 7）。

2.3 供試品溶液制備 取本品（水蜜丸或水丸）適量，研成細粉，取約1.5 g，精密稱定；另取重量差異項下的大蜜丸或裝量差異項下的小蜜丸，剪碎，取約2.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率250 W，頻率33 kHz） 處理30 min，放冷，70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按本品處方比例，分別制成缺白芍和牡丹皮、缺地黃和玄參、缺甘草、缺玄參、缺白芍的陰性樣品，按“2.3” 項下方法制備，即得。

2.5 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液各4 μL，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，陰性樣品在與對照品色譜峰相應位置處無吸收峰，表明其他成分對測定結果無影響，該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig．1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 線性關系考察 精密吸取“2.2” 項下貯備液適量，甲醇逐級稀釋成5 個質量濃度，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，并分別以信噪比S／N＝3、S／N＝10 時的質量濃度為檢出限、定量限，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系Tab．1 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，測得哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸峰面積RSD 分別為1.48%、0.14%、0.27%、0.17%、0.26%、0.16%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗 取水蜜丸（批號17035288）、大蜜丸（批號18010541） 適量，按“ 2.3” 項下方法分別制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得水蜜丸中哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸含量 RSD 分別為 1.10%、1.51%、0.65%、0.77%、0.49%、0.98%、0.51%，大蜜丸中其含量RSD 分別為1.60%、1.69%、0.94%、0.51%、0.30%、0.75%、0.12%，表明該方法重復性良好。

2.9 穩定性試驗 取“2.8” 項下水蜜丸、大蜜丸供試品溶液各1 份，于0、2、8、10、12、24 h在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得水蜜丸中哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸峰面積RSD 分別為1.05%、0.59%、0.97%、1.01%、1.14%、0.48%、0.55%，大蜜丸中其峰面積RSD 分別為1.41%、0.86%、0.99%、1.03%、1.47%、0.83%、0.64%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.10 加樣回收率試驗

2.10.1 水蜜丸 取粉碎后的本品 （批號17035288） 約0.75 g，精密稱定，精密加入對照品溶液（未稀釋） 適量，按“2.3” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸平均加樣回收率分別為 103.05%、103.51%、100.61%、97.81%、101.06%、95.67%、101.40%，RSD 分別為 1.94%、2.14%、2.92%、1.45%、1.17%、1.83%、1.46%。

2.10.2 大蜜丸 取剪碎的本品（批號18010541）約1.25 g，精密稱定，精密加入對照品溶液（未稀釋） 適量，按“2.3” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸平均加樣回收率分別為 103.46%、104.24%、100.17%、95.97%、102.65%、95.41%、101.31%，RSD 分別為0.83%、1.97%、2.62%、0.76%、2.43%、2.33%、2.35%。

2.11 樣品含量測定 取46 批樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表2。

表2 各成分含量測定結果（mg／g）Tab．2 Results of content determination of various constituents （mg／g）

3 討論

本實驗發現，哈巴苷、哈巴俄苷、芍藥苷、毛蕊花糖苷、丹皮酚、甘草苷最大吸收波長分別為210、282、230、332、274、278、252 nm，由于要使每種成分都處在最佳檢測波長下，故采用分段變換波長法。另外，丹皮酚、哈巴俄苷色譜峰保留時間、最大吸收波長相近，故在278 nm 處對兩者進行檢測。

前期報道，哈巴苷、哈巴俄苷歸屬于玄參，芍藥苷歸屬于白芍、牡丹皮［8］，丹皮酚歸屬于牡丹皮，毛蕊花糖苷歸屬于地黃［9］、玄參［10］，甘草苷、甘草酸歸屬于甘草。本實驗發現，投料質量較差的藥味主要涉及玄參、地黃，1 家企業全部3 批大蜜丸均未檢測出哈巴苷、哈巴俄苷，其中1 批未檢出毛蕊花糖苷，1 批含量較低，僅1 批含量處于中上游水平，提示該廠家應關注上述2 種藥材的投料風險；1 家企業全部3 批樣品均未檢出哈巴苷，并且哈巴俄苷含量均較低，而毛蕊花糖苷含量均處于正常水平，研究表明，不同產地玄參中哈巴苷、哈巴俄苷含量差異較大，大多數是前者高于后者，也有少數恰好相反［11-13］，提示該廠家需關注該藥材投料風險。

甘草中黃酮類（如甘草苷等）、三萜類（如甘草酸等） 化合物含量較高，為該藥材主要藥效成分［14］。研究表明，甘草中甘草苷、甘草酸含量與基原［15-16］、產地［17］、生長年限［18］相關，而本實驗中不同企業或同一企業不同批次樣品中兩者含量差異較大，與上述文獻報道一致。另外，1 家企業5批水蜜丸中甘草苷含量均處于較低水平，12 批樣品中甘草酸含量亦然，提示該廠家在后續生產中應關注該藥材質量風險。

4 結論

本實驗采用HPLC 法同時測定養陰清肺丸中哈巴苷、芍藥苷、甘草苷、毛蕊花糖苷、哈巴俄苷、丹皮酚、甘草酸的含量，該方法簡便快速，專屬性強，可有效實現對白芍、地黃、玄參、甘草、牡丹皮投料情況的考察，從而為該制劑質量控制提供理論依據、技術支撐。