基于HPLC 指紋圖譜結合化學計量學的痢瀉靈片質量評價

于密密，王安琪，杜小偉，王京輝，張文婷，陳有根，傅欣彤，郭洪祝

（北京市藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，中藥成分分析與生物評價北京市重點實驗室，北京 102206）

痢瀉靈片由拳參、穿心蓮、苦參3 味中藥組成，具有清熱解毒、止痢、止瀉功效，臨床上用于治療濕熱痢疾、熱瀉等疾病，現收載于《衛生部藥品標準》 中藥成方制劑第二冊，但僅有檢查項，并且目前關于該制劑質量控制和評價方法的報道較少［1-2］。因此，亟需完善痢瀉靈片質量標準以保障其臨床療效［3-8］。

指紋圖譜可全面、整體地表征中藥復方成分特征，是中藥制劑質量控制、一致性評價的有效手段，而化學計量學通過對指紋圖譜中復雜的中藥化學數據信息進行綜合分析和處理，可更全面地反映中藥成分特征。另外，以多種指標成分或有效成分為對象建立的質量標準更符合中藥制劑特點，也更真實全面地反映其質量［9-10］。

本實驗抽取全國3 個廠家30 批痢瀉靈片，建立該制劑HPLC 指紋圖譜，再結合主成分分析、聚類分析、正交偏最小二乘分析考察不同廠家、批次樣品的質量差異，并對所篩選出的質量差異標志物進行含量測定［11-13］，以期為該制劑質量標準提升提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LC-20A 型高效液相色譜儀，配置PDA檢測器（日本島津公司）；CP225D 型電子分析天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司）；SB-25-12DT 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SevenEasy PH 計［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］；Milli-Q 超純水系統（德國默克股份有限公司）。

1.2 試劑與藥物 沒食子酸 （批號110831-201906，純度91.5%）、苦參堿 （批號110805-202010，純度 98.7%）、氧化苦參堿 （批號110780-201909，純度92.9%）、槐果堿 （批號112052-202001，純度91.8%）、氧化槐果堿（批號111652-202202，純度93.1%）、兒茶素 （批號110877-202005，純度95.1%）、綠原酸 （批號110753-202119，純度96.3%）、穿心蓮內酯（批號110797-202010，純度99.6%） 對照品及拳參（批號 121569-201602）、穿心蓮 （批號 121082-201706）、苦參（批號121019-201708） 對照藥材（中國食品藥品檢定研究院）。痢瀉靈片共30 批，來源于3 家生產企業（A、B、C），編號P1～P30。番石榴酸（批號18935，純度99.8%，深圳市江川醫藥技術有限公司）。甲醇為色譜純（德國默克公司）；磷酸為優級純，磷酸二氫鉀、甲醇為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 XSelect CSH C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；流動相甲醇（A）-0.2%磷酸二氫鉀 （磷酸調節pH 為3.0）（B），梯度洗脫（0～20 min，5%～20% A；20～25 min，20% A；25～35 min，20%～25% A；35～40 min，25% A；40～90 min，25%～90%A；90～100 min，100%A）；體積流量0.5 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長0～45 min 215 nm，45～60 min 300 nm，60～80 min 215 nm；進樣量5 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 取沒食子酸、苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、番石榴酸、兒茶素、綠原酸、穿心蓮內酯對照品適量，40%甲醇制成質量濃度分別為 0.02、0.1、0.05、0.02、0.02、0.2、0.02、0.1、0.2 mg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品20 片或除去包衣研細，精密稱取1.0 g，精密加入40% 甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理45 min，取出，放冷，40%甲醇補足減失的質量，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.3 對照藥材溶液 精密稱取拳參、穿心蓮對照藥材各0.3 g，按“2.2.2” 項下方法制備，即得相應溶液。精密稱取苦參對照藥材0.4 g，加15 mL水加熱回流提取1 h，取出，放冷，以鋪有少量脫脂棉的漏斗過濾，濾液濃縮至約1 mL，再加入40%甲醇25 mL，按“2.2.2” 項下方法制備，即得相應溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液 按本品處方比例，分別制成缺拳參、缺穿心蓮、缺苦參的陰性樣品，按“2.2.2” 項下方法制備，即得。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗 取同一批樣品（P22），按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，以綠原酸為參照，測得各共有峰相對峰面積RSD＜2.0%，相對保留時間RSD＜2.0%，每2 針之間的相似度為1.000，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取同一批樣品（P22），按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，以綠原酸為參照，測得各共有峰相對峰面積RSD＜2.0%，相對保留時間RSD＜2.0%，每2 針之間的相似度為0.999～1.000，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取同一批樣品（P22），按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、4、10、16、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，以綠原酸為參照，測得各共有峰相對峰面積RSD ＜2.0%，相對保留時間RSD＜2.0%，每2 針之間的相似度為0.999～1.000，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.4 圖譜生成 取30 批樣品，按“2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，將數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統” 軟件（2012 年版），設定時間窗寬度為0.1 min，采用平均數法生成對照指紋圖譜，見圖1A，將其（S1） 和色譜峰較多、信號較強、峰面積較大的P2、P7～P8、P11～P12、P14～P16、P20～P22、P24、P28～P29 （S2～S15） 生成指紋圖譜，見圖1B。再采用多點校正對色譜峰進行匹配，發現17 個共有峰，各批樣品相似度見表1。

表1 30 批樣品相似度Tab．1 Similarities of thirty batches of samples

圖1 痢瀉靈片對照指紋圖譜（A） 及HPLC 指紋圖譜（B）Fig．1 Reference fingerprint （A） and HPLC fingerprints（B） for Lixieling Tablets

2.3.5 共有峰歸屬 取供試品（P22）、對照藥材、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖2，根據“2.3.4” 項下結果對17 個共有峰進行編號，通過比對藥材圖譜及其陰性圖譜并結合色譜峰保留時間，發現1 號峰（苦參堿）、4 號峰（槐果堿）、6 號峰（氧化槐果堿）、7 號峰（氧化苦參堿）、8 號峰（番石榴酸）、15 號峰來自苦參，2 號峰（沒食子酸）、3 號峰、5號峰、9 號峰、10 號峰（兒茶素）、11 號峰、12號峰（綠原酸） 峰來自拳參，12 號峰（綠原酸）、13 號峰、14 號峰、16 號峰（穿心蓮內酯）、17 號峰來自穿心蓮。

圖2 HPLC 指紋圖譜共有峰Fig．2 Common peaks in the HPLC fingerprints

2.4 化學計量學研究

2.4.1 系統聚類分析（HCA） 以共有峰峰面積為原始數據，生成30×30 階數據矩陣，采用IBM SPSS Statistics 19.0 軟件進行HCA 分析，結果見圖3。由此可知，當平方歐式距離為25 時，可將30批樣品聚為3 類，其中企業A 的P1、P3～P6 和企業B 的P17～P19 聚為一類，企業B 的P13～P16、P20～P22 和企業C 的P26～P30 聚為一類，企業A的P2、P7～P12 和企業C 的P23～P25 聚為一類，結合“2.3.4” 項下結果，發現第1 類樣品相似度最低，第3 類樣品最高。

圖3 30 批痢瀉靈片HCA 樹狀圖Fig．3 HCA dendrogram of thirty batches of Lixieling Tablets

2.4.2 主成分分析（PCA） 以共有峰峰面積為變量，導入SIMCA 14.1 軟件進行PCA 分析，結果見圖4。由此可知，累積解釋能力參數R2X、R2Y分別為0.987、0.788，均大于0.5，表明模型穩定可靠，其中P2、P13～P22 聚為一類，P23～P30、P8～P11 聚為一類，P1、P3～P7、P12 聚為一類，與“2.4.1” 項下結果基本一致。

圖4 30 批痢瀉靈片PCA 得分圖Fig．4 PCA score plot for thirty batches of Lixieling Tablets

2.4.3 正交偏最小二乘法-判別分析 （OPLSDA） 將共有峰峰面積導入SIMCA 14.1 軟件，進行OPLS-DA 分析，結果見圖5，可知所有批次樣品均落在置信區間內，可按照來源精確地被分為3類，并且組內差異較小。在α＝0.95 置信區間內，以變量投影重要性（VIP） ＞1.0 的色譜峰為差異標志物，見圖6，按VIP 值從大到小排序，依次為峰8 （番石榴酸）、峰15、峰10 （兒茶素）、峰16（穿心蓮內酯）、峰12 （綠原酸）、峰3、峰2 （沒食子酸），其中有2 個峰（峰8、峰15） 來自苦參，4 個峰（峰2、峰3、峰10、峰12） 來自拳參，2 個峰（峰12、峰16） 來自穿心蓮，可能為引起痢瀉靈片質量差異的主要變量。

圖5 30 批痢瀉靈片OPLS-DA 得分圖Fig．5 OPLS-DA score plot for thirty batches of Lixieling Tablets

圖6 OPLS-DA VIP 值Fig．6 VIP values of OPLS-DA

2.5 主要成分含量測定 采用HPLC 法。

2.5.1 色譜條件 同“2.1” 項。

2.5.2 線性關系考察 分別精密吸取番石榴酸（0.209 6 mg／mL）、兒茶素 （0.211 5 mg／mL）、綠原酸（0.104 7 mg／mL）、沒食子酸（0.004 69 mg／mL）、穿心蓮內酯（0.193 6 mg／mL） 對照品溶液1、2、5、10、15 μL，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab．2 Linear relationships of various constituents

2.5.3 專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1” 項下色譜條件進樣測定，結果見圖7。由此可知，除了綠原酸為拳參、穿心蓮共有成分外，其余成分色譜峰均無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖7 各成分HPLC 色譜圖Fig．7 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.4 精密度試驗 取“2.5.2” 項下對照品溶液適量，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定5 次，每次5 μL，測得沒食子酸，番石榴酸，兒茶素，綠原酸、穿心蓮內酯峰面積RSD 分別為0.67%、0.15%、0.09%、0.13%、0.12%，表明儀器精密度良好。

2.5.5 重復性試驗 取同一份本品（P22），按“2.2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、番石榴酸、兒茶素、綠原酸、穿心蓮內酯含量RSD 分別為 1.03%、0.89%、0.93%、0.25%、0.74%，表明該方法重復性良好。

2.5.6 穩定性試驗 取同一份供試品溶液（P22），于0、4、10、16、24 h 在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，測得沒食子酸、番石榴酸、兒茶素、綠原酸、穿心蓮內酯峰面積RSD 分別為2.06%、1.87%、1.51%、0.83%、1.44%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.5.7 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的同一份本品（P22） 6 份，每份0.5 g，精密加入“2.2.1” 項下對照品溶液適量，按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，沒食子酸、番石榴酸、兒茶素、綠原酸、穿心蓮內酯平均加樣回收率分別為103.1%、97.29%、101.4%、104.0%、100.8%，RSD 分別為1.09%、0.63%、1.54%、0.44%、1.66%。

2.5.8 樣品含量測定 取30 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表3。

表3 各成分含量測定結果（mg／g）Tab．3 Results of content determination of various constituents （mg／g）

3 討論

本實驗從全國29 個省市不同流通領域中抽取不同企業生產的30 批痢瀉靈片作為對象，具有代表性。結果，各批樣品HPLC 指紋圖譜中有17 個共有峰，并指認出其中9 個；以相似度不得低于0.90 為標準，有7 批低于限度，占所有批次的23.3%，表明不同企業或同一企業不同批次樣品之間存在差異。

然后，采用系統聚類分析、主成分分析、偏最小二乘法判別分析來提取相關化學數據，發現30批痢瀉靈片聚為3 類，質量標志物有7 個，其含量測定結果表明不同企業樣品批間質量不一，存在投料方式不規范、投料藥材質量差的問題。因此，痢瀉靈片在整體質量控制方面還存在一些不足，需在今后加以改進。

4 結論

本實驗采用HPLC 指紋圖譜結合化學計量學對痢瀉靈片質量進行評價，所篩選出的指標成分能代表該制劑所有藥味特征，并且該方法準確簡便，重復性好，可為其更全面的質量控制提供實驗依據［14-22］。