糖通飲對糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化的延緩作用

陳洪民，潘艷伶，伏紅穎，楊 紅，凌湘力

（1.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院，貴州 貴陽 550004）

糖尿病腎病不僅是糖尿病的主要并發癥之一，也是終末期腎臟病的主要原因［1-2］。腎臟纖維化是糖尿病腎病最主要的病理特征，表現在細胞外基質（ECM） 在腎小球基底膜和腎小管間質中異常沉積［3］。腎臟功能的損傷與腎臟纖維化密切相關，對抗腎臟纖維化是減輕糖尿病腎病的內在機制。但目前臨床上尚無治療腎臟纖維化的特效藥物［4-5］。

轉化生長因子-β1（TGF-β1） 被認為是作用最強的致纖維化細胞因子，介導多種信號參與腎臟纖維化的過程［6］。研究表明，microRNA-21 （miRNA-21） 亦與腎臟的纖維化相關，miRNA-21 基因缺失能夠抑制糖尿病腎病小鼠的腎臟纖維化，其機制可能與調控TGF-β1及相關基質蛋白有關［7］。

“糖通飲” 是全國名中醫凌湘力教授臨床治療糖尿病腎病所創建的經驗方。課題組在前期研究中已證實糖通飲對糖尿病腎病大鼠腎臟功能具有保護作用［8-9］，但其具體機制尚未完全明確。故本研究擬通過觀察糖通飲對糖尿病腎病大鼠腎臟miRNA-21、TGF-β1的影響，初步探討糖通飲延緩糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化來保護腎臟的作用機制，以期為臨床防治糖尿病腎病，延緩腎臟纖維化提供新的選擇，并進一步從分子生物學層面揭示其作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級雄性SD 大鼠60 只，體質量（180±20） g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK （遼） 2020-0001。大鼠飼養于貴州省常見慢性疾病發病機制及藥物研究重點實驗室，溫度22～26 ℃，相對濕度40%～60%，自由攝水攝食。實驗經貴州醫科大學實驗動物倫理委員會批準（審批號2000575）。

1.2 藥物 糖通飲顆粒制劑由廣東一方制藥有限公司提供，由生地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、丹皮、黃芪、丹參、地骨皮、草決明組成，將20.69 g 糖通飲顆粒制劑充分溶于23 mL 去離子水中，生藥質量濃度為6 g／mL （20.69 g 糖通飲顆粒制劑即一劑糖通飲生藥劑量）。厄貝沙坦片（國藥準字J20171089），由法國Sanofi 公司提供，使用去離子水制成質量濃度為2 mg／mL 的母液。

1.3 試劑 鏈脲佐菌素（STZ，貨號V900890）購自美國Sigma 公司；尿蛋白定量試劑盒（貨號C035-2-1） 購自南京建成生物工程研究所；逆轉錄試劑盒（貨號11141ES10）、PCR 熒光定量試劑盒（貨號1184ES25） 購自上海翊圣生物科技有限公司；miRNA 熒光定量 PCR 試劑盒 （貨號R11068.5） 購自廣州銳博生物技術有限公司；一抗（兔抗鼠） TGF-β1（貨號EPR21143）、Smad2（貨號EP784Y）、Smad3 （貨號EP568Y） 購自英國Abcam 公司；Col-Ⅲ （貨號22734-1-AP）、FN（貨號15613-1-AP）、GAPDH （貨號HRP-60004）、二抗（羊抗兔） HRP 標記lgG （貨號SA00001-2）購自武漢三鷹生物技術有限公司；ECL 超敏化學發光液（貨號H31500-1） 購自常州天地人和生物科技有限公司；改良Masson 三色染色試劑盒（貨號G1346） 購自北京索萊寶科技有限公司；免疫組織化學鏈霉親和素-過氧化物酶兩步法檢測試劑盒（貨號PV-9000）、二氨基聯苯胺顯色液（貨號ZLI-9018） 購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4 儀器 穩豪倍易型血糖儀（美國Johnson ＆Johnson 公司）；Cobasc702 型全自動生化分析儀（瑞士Roche 公司）；CFX96 型實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad 公司）；Tanon-5200 型凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）；BX53 型生物顯微鏡（日本Olypums 公司）。

2 方法

2.1 糖尿病腎病大鼠模型復制 將大鼠適應性喂養1 周后，隨機抽取10 只為正常組，給予基礎飼料喂養8 周；其余50 只大鼠為造模組進行糖尿病腎病造模，給予高脂高糖飲食（常規飼料58%、精煉豬油20%、糖20%、膽固醇2%），喂養8 周。相應飼料喂養結束后，禁食不禁水12 h，造模組大鼠腹腔注射含1% STZ 的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5），正常組大鼠腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液，注射3 次，劑量分別為20、25、30 mg／kg，每次間隔72 h。造模組大鼠于第3 次注射結束72 h 后，連續3 次（每次間隔24 h） 檢測空腹血糖，若大于16.7 mmol／L，且伴有飲水量、尿量增加，判定大鼠糖尿病模型造模成功。繼續給予高脂高糖飲食喂養3 周，每周固定時間監測空腹血糖，代謝籠收集24 h 尿液檢測24 h 尿蛋白定量，若24 h 尿蛋白≥30 mg，則判定大鼠糖尿病腎病模型造模成功［10］。

2.2 分組與給藥 大鼠糖尿病腎病模型造模成功后，隨機分為模型組，糖通飲低、中、高劑量組，厄貝沙坦組，每組10 只。糖通飲低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予糖通飲顆粒制劑6.21、12.42、24.84 g／kg，每天1 次，連續8 周（大鼠用量按人與動物體表面積的等效比值表折算，分別為成人用量的0.5、1、2 倍）；厄貝沙坦組大鼠灌胃給予13.5 mg／kg 厄貝沙坦片溶液，每天1 次，連續8 周（為成人等效劑量）；正常組與模型組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水，連續8 周。給藥期間，各組大鼠均以基礎飼料喂養，自由攝水攝食。

2.3 生化指標檢測 給藥8 周后，代謝籠收集24 h尿液并采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠尿微量白蛋白水平；禁食不禁水12 h，尾靜脈取血測空腹血糖后，腹腔注射10% 水合氯醛3 mL／kg 麻醉，股動脈取血，離心取血清，全自動生化分析儀檢測各組大鼠空腹血糖、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平；迅速摘取左、右腎組織并稱定質量，一部分置于4%多聚甲醛中固定，其余置于-80 ℃冰箱中冷凍保存。

2.4 HE、Masson 和免疫組織化學染色觀察大鼠腎組織病理學變化 取4%多聚甲醛固定的大鼠腎組織，制成4 μm 的石蠟切片，嚴格按照相關試劑盒說明書進行HE 和Masson 染色，觀察各組大鼠病理學形態。采用免疫組化SP 二步法，將石蠟切片脫臘、水化及微波爐抗原修復，3%H2O2孵育，加入一抗TGF-β1（1 ∶25）、FN （1 ∶50）、Col-Ⅲ（1 ∶50），4 ℃孵育過夜。PBS 洗滌后，二抗孵育，DAB 溶液顯色，顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.5 RT-qPCR 法檢測大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表達 TRIzol 法提取各組大鼠腎組織總RNA，分光光度法檢測并計算其含量及濃度。由上海生工工程技術有限公司設計合成 TGF-β1、FN、Col-Ⅲ引物，見表 1，用YEASEN 試劑盒進行逆轉錄合成cDNA；由廣州銳博生物技術有限公司設計合成miRNA-21 引物，RiboBio 試劑盒進行逆轉錄合成cDNA，步驟及反應體系均嚴格按照相關試劑盒說明書操作。PCR擴增條件為50 ℃ 30 min；95 ℃ 10 min；95 ℃2 s，60 ℃20 s，70 ℃10 s，40 個循環；70 ℃10 min。以U6 和GADPH為內參，記錄各樣本CT值，采用2-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達，重復3 次。

表1 引物序列Tab．1 Primer sequences

2.6 Western blot 法檢測大鼠腎組織TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表達 取0.1 g 腎組織，加入500 μL RIPA 裂解液研磨，離心取上清，BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。加入1.5×上樣緩沖液，煮沸后，經SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白并轉移至PVDF 膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，1×TBST洗膜3 次，加入兔抗鼠GAPDH （1 ∶7 000）、TGFβ1（1 ∶1 000）、FN （1 ∶500）、Col-Ⅲ（1 ∶500）一抗，在4 ℃下孵育過夜，次日TBST 洗膜3 次，加入山羊抗兔IgG-HRP 二抗稀釋液，室溫孵育1 h，ECL 顯影，Tanon 凝膠成像系統掃描成像，采用Image J 軟件對條帶進行分析，以GAPDH 為內參，計算TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白相對表達。

2.7 統計學分析 通過SPSS 26.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素ANOVA 檢驗，組間比較兩兩采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 糖通飲對大鼠腎臟肥大指數、空腹血糖、24 h尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎臟肥大指數、空腹血糖、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，糖通飲各劑量組大鼠腎臟肥大指數、空腹血糖、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平降低（P＜0.05），厄貝沙坦組大鼠腎臟肥大指數、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟肥大指數、空腹血糖、24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐水平變化（±s，n＝6）Fig．1 Changes in the renal hypertrophy index，FBG，24 h ALB，BUN and SCr of rats in each group （±s，n＝6）

3.2 糖通飲對大鼠腎組織病理形態學的影響 正常組大鼠腎臟結構排列完整清晰；模型組大鼠可見腎小球系膜增生明顯，基底膜增厚，腎小球體積增大，腎小管萎縮，管腔狹窄；糖通飲各劑量組及厄貝沙坦組大鼠的病變程度均降低，見圖2。與正常組比較，模型組大鼠腎小球內及腎小管間質藍色物質呈強陽性，膠原纖維增多（P＜0.05）；與模型組比較，糖通飲中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠藍色物質減少（P＜0.05），色淺，膠原沉積減少，見圖3。

圖2 各組大鼠腎組織HE 染色（×400）Fig．2 HE staining of rat kidney tissues in each group（×400）

圖3 各組大鼠腎組織膠原沉積情況（×400，±s，n＝6）Fig．3 Collagen deposition of rat kidney tissues in each group （×400，±s，n＝6）

3.3 糖通飲對大鼠腎組織TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表達的影響 正常組大鼠腎組織TGF-β1主要在腎小管上皮細胞胞質、腎小球系膜區有少量表達，FN、Col-Ⅲ主要在腎小管、腎小管間質表達，腎小球內也有少量表達，均呈棕黃色顆粒或團塊散在分布；與正常組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表達升高（P＜0.05），顏色深；與模型組比較，糖通飲中、高劑量組與厄貝沙坦組大鼠腎組織TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表達降低 （P＜0.05），見圖4。

圖4 各組大鼠腎組織TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表達（×400，±s，n＝6）Fig．4 Protein expressions of TGF-β1，Col-Ⅲand FN of rat kidney tissues in each group （×400，±s，n＝6）

3.4 糖通飲對大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，糖通飲低劑量組大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表達差異無統計學意義 （P＞0.05），糖通飲中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FNmRNA 表達降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、Col-Ⅲ、FN mRNA 表達（±s，n＝6）Fig．5 mRNA expressions of miRNA-21，TGF-β1，Col-Ⅲand FN of the rat kidney tissues in each group （±s，n＝6）

3.5 糖通飲對大鼠腎組織TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表達升高 （P＜0.05）；與模型組比較，糖通飲低劑量組大鼠腎組織TGFβ1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表達無顯著差異（P＞0.05），糖通飲中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠腎組織TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表達降低 （P＜0.05），見圖6～7。

圖6 各組大鼠腎組織TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白條帶圖Fig．6 Bands of TGF-β1、Col-Ⅲand FN proteins of the rat kidney tissues in each group

圖7 各組大鼠腎臟組織TGF-β1、Col-Ⅲ、FN 蛋白表達（±s，n＝6）Fig．7 Protein expressions of TGF-β1、Col-Ⅲand FN of the rat kidney tissues in each group （±s，n＝6）

4 討論

在祖國醫學中，沒有關于糖尿病腎病的病名記載，但根據其臨床表現，當屬中醫學消渴并“虛勞” “腎勞” “水腫” 等范疇。全國名中醫凌湘力教授認為糖尿病腎病是由糖尿病發展演變而來的一種虛實夾雜的并病，其基本病機以氣陰兩虛為本，痰瘀濁毒阻絡為標。據此創建經驗方“糖通飲”，方中君藥黃芪及臣藥山萸肉、生地黃、山藥可補肝腎、調氣陰以固本；佐使藥配以地骨皮、茯苓、草決明、丹參、丹皮、澤瀉，以祛痰瘀濁毒，疏通腎絡，諸藥合用補泄兼施，標本同治。臨床使用能有效控制糖尿病腎病患者血糖，降低蛋白尿，保護腎與模型組比較，＃P＜0.05。功能，延緩糖尿病腎病進展［11-12］。

糖尿病腎病作為糖尿病嚴重的微血管并發癥之一，腎臟纖維化是最重要的病理生理過程［13-14］。早期可見ECM 過度沉積、腎小球基底膜增厚，大量膠原沉積，逐漸出現腎小球硬化及腎臟纖維化［15］。該病理過程與糖尿病腎病嚴重程度相關，是其進展的標志，現代醫學主要通過控制血糖、血壓、蛋白尿等手段改善糖尿病腎病狀態，但長期預后仍不佳。血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑厄貝沙坦即是臨床常用于延緩糖尿病腎病腎損傷的用藥，具有降壓、減輕尿蛋白的作用［16-17］。本研究HE、Masson染色可見，模型組大鼠腎組織系膜細胞增生，基底膜增厚，膠原纖維沉積；24 h 尿微量白蛋白、血尿素氮、血肌酐降低；而經各劑量糖通飲及厄貝沙坦干預后，均能不同程度減輕其腎臟病理損傷，延緩腎臟纖維化進展，且中劑量糖通飲即能取得與厄貝沙坦相似的療效，并擁有厄貝沙坦單用所不具備的改善血糖作用。

糖尿病腎病腎臟纖維化機制復雜，多種細胞因子和信號通路的激活參與了其發病過程。其中TGF-β1被認為是腎小球硬化和腎小管間質纖維化機制中最關鍵的細胞因子［18］，他能通過激活其下游因子，刺激ECM 生成并抑制其降解，促進腎臟纖維化［19］。同時miRNA-21 的表達亦與腎臟纖維化相關，miRNA-21 上調可促進腎臟纖維化，其機制可能依賴與TGF-β1及其相關通路的協同作用［20-22］。故為了進一步驗證糖通飲延緩腎臟纖維化的機制，本研究檢測miRNA-21、TGF-β1以及ECM 主要成分蛋白FN、Col-Ⅲ表達，結果發現，與正常組比較，模型組大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表達升高；而經過藥物干預，除糖通飲低劑量組對以上指標影響不顯著，糖通飲中、高劑量組及厄貝沙坦組大鼠腎組織miRNA-21、TGF-β1、FN、Col-Ⅲ表達均降低，組間差異不顯著。由此可知，糖通飲對腎臟纖維化的影響可能與下調miRNA-21、TGF-β1表達相關。

綜上所述，糖通飲能夠延緩糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化，保護腎臟功能，且使用中劑量糖通飲時即可產生較佳效果，其機制可能是通過對miRNA-21、TGF-β1的調控，減少ECM 的沉積產生的。