健脾祛濕膏對肝郁脾虛型腹瀉型腸易激綜合征大鼠的作用

謝翔雨，盧 琴，甘劍峰，盧淑婷，熊 維，楊惠霏，何國棟，黃育生，唐洪梅

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫藥大學嶺南醫學研究中心，廣東 廣州 510405；3.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510120；4.廣州中醫藥大學青蒿研究中心，廣東 廣州 510405；5.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405）

腸易激綜合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D） 臨床表現為腹痛腹瀉伴隨情緒失調，病情遷延難愈，我國患病率約10%，在醫學生、護士等人群中患病率甚至高達30%［1-2］，嚴重降低了患者的生活質量，增加了醫療負擔。IBS-D 病因復雜，通常認為它與情志失調、腸道菌群改變、腸道通透性提高、腸道低度免疫激活［1，3］等相關。

健脾祛濕膏是由四君子湯、四逆散、葛根芩連湯等經典名方加減化裁而來的經驗方，具有健脾祛濕、疏肝解郁之效。該膏方療效確切，是廣州中醫藥大學第一附屬醫院臨床上常用于治療肝郁脾虛泄瀉的經驗方。課題組前期研究表明，健脾祛濕膏能夠改善脾虛腹瀉模型大鼠的脾虛狀態，降低結腸炎癥水平［4-5］。本研究通過復制肝郁脾虛型IBS-D 大鼠模型，觀察健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠的作用，及其對5-HT 受體、緊密連接蛋白表達和cGAS-STING通路的影響，探討其可能的作用機制，以期為健脾祛濕膏臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 SPF 級SD 大鼠，購于廣州中醫藥大學動物實驗中心 ［實驗動物生產許可證號SCXK（粵） 2018-0034］，飼養于廣州中醫藥大學第一附屬醫院SPF 級動物房［實驗動物使用許可證號SYXK （粵） 2018-0092］，實驗經動物倫理委員會審批通過（倫理號TCMF1-2021042）。飼養環境為溫度（24±2）℃，相對濕度55%～68%，晝夜節律12 h／12 h，自由進食進水。

1.2 藥物與試劑 健脾祛濕膏（廣州中醫藥大學第一附屬醫院，批號20210707），加適量蒸餾水于研缽中研勻，配成237 g／L 的溶液；匹維溴銨（法國Abbott Healthcare SAS 公司，批號714641）；補脾益腸丸 （華潤三九醫藥股份有限公司，批號2109004H）。冰醋酸（天津市大茂化學試劑廠，貨號DJDM000091）；舒泰［法國維克公司，進口獸藥注冊證號（2015） 外獸藥證字43 號］；大鼠β干擾素ELISA 試劑盒（江蘇酶免實業有限公司，貨號MM-61514R1）；RIPA 裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒、BSA 封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、二抗羊抗兔／羊抗鼠（北京蘭杰柯科技有限公司，貨號BL504A、BL507A、BL521A、BL535A、BL506A、BL536A、BL003A／BL001A）；STING、p-TBK1 抗體［艾比瑪特醫藥科技（上海）有限公司，貨號TD12090、T58364S］；Claudin-1、TBK1 抗體（美國Proteintech 公司，貨號28674-1-AP、67211-1-Ig）；ZO-1 抗體（武漢博士德生物工程有限公司，貨號PB9234）；β-tubulin、GAPDH抗體 （美國 Affinity 公司，貨號 AF7011、AF7021）；彩色預染蛋白質marker、超敏ECL 化學發光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號P0068、P0018S）；RNA 提取試劑 （TRIzol）、RNA 逆轉錄試劑盒、SYBR Green q-PCR 試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司，貨號AG21102、AG11706、AG11701）。

1.3 儀器 Multiskan GO 型全波長酶標儀、QuantStudioTM5 型實時熒光定量PCR 儀、Veriti 型梯度PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；ChemiDoc MP 型全能型凝膠成像系統、165-8001 型垂直板電泳槽 （美國Bio-Rad 公司）；GeneSpeed冷凍離心機 （香港基因有限公司）；Pannoramic MIDI 型數字病理切片掃描儀（匈牙利3Dhistech 公司）；TS-2 型搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；AL1240 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

2 方法

2.1 IBS-D 模型復制 參照課題組前期研究［6-7］復制IBS-D 模型大鼠，第1～14 天，將SD 大鼠乳鼠每日上午9 時與母鼠分離3 h。第15～28 天，將乳鼠倒置，把潤滑后的直腸給藥管伸入乳鼠肛門4 cm處，以0.087 mol／L 醋酸0.2 mL 灌腸，每隔1 d 增加0.1 mL，直至灌腸體積為0.5 mL 后保持不變。灌腸后隨即用醫用膠帶束縛大鼠上肢，每天束縛2 h。第29 天后停止醋酸刺激2 周，但仍每天束縛大鼠2 h，直至第43 天。

2.2 分組與給藥 第43 天（大鼠6 周齡時），將模型復制成功的大鼠隨機分為模型組、補脾益腸丸組（1.89 g／kg）、匹維溴銨組（15.8 mg／kg） 和健脾祛濕膏低、高劑量組（2.1、4.2 g／kg，分別相當于臨床等效劑量1、2 倍），連同實驗最初隨機抽取的空白組（灌腸時以等量生理鹽水代替，但不進行母嬰分離和束縛操作） 一共6 組，每組8只，雌雄各半，按照10 mL／kg 給藥量進行灌胃，共給藥14 d （空白組給予蒸餾水）。

2.3 動物行為學考察

2.3.1 糞便含水量測定 參照文獻［6］ 報道方法，末次給藥2 h 后，用5 mL EP 管收集每只大鼠糞便，稱定質量，即為濕重；置于60 ℃烘箱中干燥至恒重，稱定質量，即為干重，計算糞便含水率，公式為糞便含水率＝［（糞便濕重-糞便干重）／糞便濕重］ ×100%。

2.3.2 大鼠腸道疼痛閾值測定 將大鼠置于自制的玻璃容器內，將6F 導尿管一端用潤滑油擦拭后，插入大鼠肛門約6 cm 處，用醫用膠帶將導尿管與大鼠尾巴根部固定，另一端與充滿水的1 mL 注射器相連接。待大鼠情緒穩定后，緩慢推動注射器，當大鼠腹部肌肉強烈收縮并抬離桌面時，停止推動，并記錄此時的注水量。

2.3.3 糖水偏好值測定 參照文獻［6］ 報道方法，在給藥的第12～14 天，于前1 天晚上將大鼠禁食禁水12 h，第2 天早上9 時給予每籠大鼠已稱重的1%蔗糖水和蒸餾水各1 瓶，1 h 后取下再次稱重，計算糖水偏好值，公式為糖水偏好值＝［消耗的糖水重／（消耗的糖水+消耗的蒸餾水）］ ×100%。

2.4 樣本收集 給藥結束后，使用20 mg／mL 舒泰（0.3 mL／kg） 麻醉大鼠，隨后頸椎脫臼處死。收集各組大鼠遠端結腸，剪取約1 cm 結腸組織置于4%多聚甲醛溶液中常溫放置，其余結腸組織裝于冷凍管中，于-80 ℃冰箱中保存；另取脾臟，稱重，計算脾臟系數，公式為脾臟系數＝（脾臟質量／大鼠質量） ×100%。

2.5 HE 染色觀察結腸組織病理形態 取于4%多聚甲醛溶液中固定的結腸組織，PBS 沖洗，依次在濃度梯度的乙醇中脫水，二甲苯透明，于石蠟中包埋，切片，二甲苯脫蠟，蘇木素-伊紅 （HE） 染色，脫水后用中性樹膠封片，在切片掃描儀下進行掃描和觀察。

2.6 ELISA 法檢測結腸組織IFN-β 水平 取結腸組織50 mg，加入預冷的PBS 450 μL，于冰上剪碎后勻漿，4 ℃、12 000 r／min 離心20 min，取上清液，按照BCA 試劑盒說明書測定結腸組織蛋白濃度，再按照ELISA 試劑盒說明書檢測結腸組織IFN-β 水平。

2.7 RT-qPCR 法檢測結腸組織5-HT1A、5-HT2A、TNF-α、Claudin-1、ZO-1、cGAS、STINGmRNA 表達 取結腸組織100 mg，加TRIzol 1 mL，剪碎后勻漿，以TRIzol 法提取總RNA，測定RNA 濃度后，按照逆轉錄試劑盒說明書操作步驟將總RNA逆轉錄為cDNA，置于-20 ℃保存備用。臨用時將cDNA 加DEPC 水稀釋20 倍后備用，反應體系為10 μL （SYBR Green 5 μL，正向引物、反向引物、ROX 各0.2 μL，稀釋后的cDNA 4.4 μL），按照說明書設定程序進行qPCR 反應。所有引物通過NCBI 網站進行設計，由廣州昂科生物技術有限公司合成，引物序列見表1。以β-actin為內參，通過2-ΔΔCT法計算各基因的mRNA 相對表達量。

表1 引物序列Tab．1 Primer sequences

2.8 Western blot 法檢測結腸組織Claudin-1、ZO-1、cGAS-STING 通路相關蛋白表達 取結腸組織100 mg，加入RIPA 裂解液（含PMSF） 200 μL，剪碎后勻漿，后將裂解液補足至1 mL，于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r／min 離心10 min，取上清液，按照BCA 試劑盒說明書測定蛋白濃度，取部分上清液加入Loading Buffer 配成3 μg／μL 的蛋白樣品，于-20 ℃保存，其余上清液于-80 ℃保存。每孔上樣10 μL，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，冰浴條件下濕轉至0.45 μm PVDF 膜上，TBST 洗膜后使用BSA 封閉液室溫封閉1 h，分別加入Claudin-1 （1 ∶1 000）、ZO-1 （1 ∶1 000）、p-TBK1（1 ∶1 000）、TBK1 （1 ∶1 000）、STING （1 ∶1 000）、GAPDH （1 ∶3 000） 一抗4 ℃孵育過夜，次日TBST 洗膜，室溫孵育二抗（1 ∶4 000） 1 h，滴加化學發光顯影液，于凝膠成像系統下顯影，使用Image J 軟件進行分析。

2.9 統計學分析 通過SPSS 24 和GraphPad Prism 8.0 軟件進行處理，計量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析；計數資料以百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般狀況觀察 空白組大鼠毛色潔白光澤，肛周干凈，四肢及尾部溫熱，體質量增長迅速，精神狀態良好；模型組皮毛光澤暗淡，大便不成型，肛周污穢，四肢及尾部體溫較低，體質量增長緩慢，平時靜臥少動，喜好扎堆，刺激后煩躁不安，相互撕咬，提示模型復制成功；給藥結束后，各給藥組毛色潔白有光澤，大便成型，肛周干凈，提示各給藥組可改善IBS-D 模型大鼠的一般狀況。

3.2 健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠體質量的影響 如圖1 所示，與空白組比較，模型組和各給藥組雄性大鼠體質量均降低（P＜0.01），模型組和補脾益腸丸組雌性大鼠體質量降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠體質量均有上升趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠體質量的影響（±s，n＝8）Fig．1 Effects of Jianpi Qushi Paste on the weight of IBS-D rats （±s，n＝8）

3.3 健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠糞便含水率、脾臟系數、腸道疼痛閾值、糖水偏好值的影響 如表2所示，與空白組比較，模型組大鼠糞便含水率、脾臟系數升高（P＜0.01），疼痛閾值、糖水偏好值降低（P＜0.01），提示模型復制成功。與模型組比較，各給藥組大鼠大鼠糞便含水率降低（P＜0.05，P＜0.01），疼痛閾值升高（P＜0.05，P＜0.01），內臟敏感得到改善；補脾益腸丸組和健脾祛濕膏各劑量組脾臟系數降低（P＜0.05）；補脾益腸丸組和健脾祛濕膏低劑量組糖水偏好值升高（P＜0.05）。

表2 健脾祛濕膏對IBS-D 模型大鼠糞便含水率、腸道疼痛閾值、脾臟指數、糖水偏好值的影響（±s，n＝6～8）Tab．2 Effects of Jianpi Qushi Paste on fecal water content，intestinal pain threshold，spleen index level and preference value of sugar water in IBS-D model rats （±s，n＝6-8）

表2 健脾祛濕膏對IBS-D 模型大鼠糞便含水率、腸道疼痛閾值、脾臟指數、糖水偏好值的影響（±s，n＝6～8）Tab．2 Effects of Jianpi Qushi Paste on fecal water content，intestinal pain threshold，spleen index level and preference value of sugar water in IBS-D model rats （±s，n＝6-8）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別糞便含水率／%腸道疼痛閾值／mL脾臟系數／%糖水偏好值／%空白組57.488±4.8450.763±0.0740.226±0.02285.523±2.705模型組69.194±4.367**0.375±0.071**0.365±0.053**66.277±6.509**補脾益腸丸組56.513±3.266＃＃0.663±0.106＃＃0.290±0.030＃83.617±4.512＃＃匹維溴銨組61.410±4.083＃0.600±0.076＃＃0.326±0.06164.673±11.347健脾祛濕膏低劑量組57.988±2.378＃＃0.613±0.099＃＃0.276±0.034＃79.452±3.912＃健脾祛濕膏高劑量組63.251±3.495＃0.550±0.093＃0.293±0.042＃73.428±5.243

3.4 健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠結腸組織病理形態的影響 如圖2 所示，各組大鼠結腸上皮細胞排列齊整，黏膜完整，腺體結構正常，未見明顯腸道水腫、腸黏膜損壞、炎癥細胞因子浸潤的情況，均不存在器質性病變，符合IBS 模型病理學表現。

圖2 各組大鼠結腸組織HE 染色（×50）Fig．2 HE staining of rat colon tissue for each group（×50）

3.5 健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠結腸組織IFN-β 水平的影響 如圖3 所示，與空白組比較，模型組大鼠結腸組織IFN-β 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結腸組織IFN-β 水平均降低（P＜0.01）。

圖3 健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠結腸組織IFN-β 水平的影響（±s，n＝8）Fig．3 Effects of Jianpi Qushi Paste on IFN-β level in colon tissue of IBS-D rats （±s，n＝8）

3.6 健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠結腸組織5-HT1A、5-HT2A、TNF-αmRNA 表達的影響 如圖4 所示，與空白組比較，模型組大鼠結腸組織5-HT1A、5-HT2A、TNF-αmRNA 表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結腸組織5-HT2A、TNF-αmRNA 表達均降低（P＜0.05，P＜0.01），補脾益腸丸組和健脾祛濕膏各劑量組大鼠結腸組織5-HT1AmRNA 表達均降低（P＜0.01）。

圖4 健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠結腸組織5-HT1A、5-HT2A、TNF-α mRNA 表達的影響（±s，n＝8）Fig．4 Effects of Jianpi Qushi Paste on 5-HT1A，5-HT2A and TNF-α mRNA expressions in colon tissue of IBS-D rats （±s，n＝8）

3.7 健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠結腸組織Claudin-1、ZO-1 mRNA 及蛋白表達的影響 如圖5～6 所示，與空白組比較，模型組大鼠結腸組織Claudin-1、ZO-1 mRNA 及蛋白表達均降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結腸組織Claudin-1、ZO-1 mRNA 和Claudin-1 蛋白表達均升高（P＜0.05，P＜0.01），補脾益腸丸組和健脾祛濕膏各劑量組大鼠結腸組織ZO-1 蛋白表達升高 （P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠結腸組織Claudin-1、ZO-1 mRNA 表達的影響（±s，n＝6）Fig．5 Effects of Jianpi Qushi Paste on Claudin-1 and ZO-1 mRNA expressions in colon tissue of IBS-D rats （±s，n＝6）

圖6 健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠結腸組織Claudin-1、ZO-1 蛋白表達的影響（±s，n＝3）Fig．6 Effects of Jianpi Qushi Paste on Claudin-1 and ZO-1 protein expressions in colon tissue of IBS-D rats （±s，n＝3）

3.8 健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠結腸組織cGASSTING 信號通路相關靶點mRNA 和蛋白表達的影響 如圖7～8 所示，與空白組比較，模型組大鼠結腸組織cGAS、STINGmRNA 和STING、TBK1、p-TBK1 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠結腸組織cGAS、STINGmRNA 和STING、TBK1、p-TBK1 蛋白表達降低（P＜0.01）。

圖7 健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠結腸組織cGAS、STING mRNA 表達的影響（±s，n＝8）Fig．7 Effects of Jianpi Qushi Paste on cGAS and STING mRNA expressions in colon tissue of IBS-D rats （±s，n＝8）

圖8 健脾祛濕膏對IBS-D 大鼠結腸組織STING、TBK1、p-TBK1 蛋白表達的影響（±s，n＝4）Fig．8 Effects of Jianpi Qushi Paste on protein expressions of STING，TBK1 and p-TBK1 in colon tissue of IBS-D rats （±s，n＝4）

4 討論

中醫理論認為IBS-D 屬于“泄瀉” “腹痛” 范疇，肝郁脾虛被認為是IBS-D 的基本病機［8］。本實驗結果表明，健脾祛濕膏能夠增加IBS-D 大鼠體質量，減輕腹瀉程度，使脾臟系數恢復至正常水平，并改善行為學表現，提示健脾祛濕膏能夠改善IBSD 大鼠腹瀉和脾虛肝郁的狀態。

5-HT 屬于腦腸肽的一種，胃腸道是體內5-HT最豐富的來源，它對腸道運動、腸道分泌和內臟敏感性有著重要的調節作用［9］。5-HT1A、5-HT2A受體拮抗劑因其在內臟疼痛模型中具有鎮痛作用，被認為是治療IBS-D 的靶點［10-11］。本實驗結果表明，模型組大鼠5-HT1A、5-HT2AmRNA 表達均高于空白組，這與先前相關報道的研究結果一致［10］；健脾祛濕膏給藥后5-HT1A、5-HT2AmRNA 表達降低，提示健脾祛濕膏治療IBS-D 可能與其解郁止痛的功效相關。

緊密連接（TJs） 是一種多蛋白復合物，負責調節細胞間的通透性［12］。TJs 控制抗原通過腸上皮屏障的傳遞，并在維持屏障的完整性方面起著關鍵作用。TJs 蛋白表達降低，導致腸道屏障功能受損，進而引發腸道通透性的改變，細菌及其代謝物“滲漏” 進入腸道內部和全身循環，導致黏膜甚至全身免疫激活被放大，而免疫的激活又有可能反過來加重腸道屏障的損害程度［12］。因此腸道屏障功能的受損可能是導致IBS-D 患者和模型動物糞便含水率升高和腸道低度炎癥的重要原因［12-14］。本實驗結果表明，Claudin-1 和ZO-1 作為緊密連接蛋白家族代表性成員，其在模型組中mRNA 和蛋白表達均降低；經健脾祛濕膏干預后，Claudin-1 和ZO-1 表達有所上升。

IBS-D 的腸道屏障完整性受損可能導致微生物穿過腸道屏障進入固有層而激活免疫應答。有研究報道稱，IBS-D 患者體內TNF-α 水平提高，并與腹瀉程度相關［3，15］，提示腸道內存在炎性應答。cGAS-STING 信號通路屬于固有免疫，在維持腸道穩態中起著重要作用，但其過度激活會促進炎癥細胞因子的釋放破壞腸道免疫穩態［16-18］。cGAS 可以識別細胞質中細菌所泄露的游離DNA，合成第二信使環鳥苷酸-腺苷酸 （cyclin GMP-AMP，cGAMP），以激活下游的STING 受體蛋白［4］。STING 作為此通路的樞紐，還能被細菌環二核苷酸（cyclic dinucleotides，CDNs） 直接激活，促進TBK1 募集和磷酸化，從而促使I 型干擾素（如IFN-β） 的轉錄和表達。在生理狀態下，腸道分泌一定水平的IFN-β 能使腸道及時應對入侵的微生物，但其過度表達會加劇免疫細胞的激活，引起免疫微環境失衡［19-20］。本實驗結果表明，IBS-D 大鼠結腸組織cGAS-STING 通路被激活；給予健脾祛濕膏干預后，cGAS-STING 通路受到抑制。

綜上所述，本研究表明，健脾祛濕膏具有疏肝健脾止瀉的功效，能夠改善IBS-D 大鼠情志不調、腹瀉、內臟高敏感，上調緊密連接蛋白Claudin-1、ZO-1 表達。同時，本研究表明IBS-D 大鼠結腸組織cGAS-STING 通路被激活，促炎因子IFN-β 釋放增加，健脾祛濕膏干預可抑制cGAS-STING 通路活化。