淫羊藿苷對尾懸吊模擬失重誘導大鼠骨丟失的防護作用

白亞楠，萬美玉，狄曉可，張志斐，李小娜，李 洋

（華北理工大學藥學院，河北 唐山 063210）

近年來國內外航天事業發展較快，但太空微重力環境卻給航天人員的身體健康帶來了嚴重威脅。已有較多研究證明微重力可以引起嚴重的骨丟失現象［1-2］。骨丟失是骨質疏松的病理特點之一，在微重力環境下，破骨細胞功能增強，成骨細胞活性降低［3］，打破了骨重建動態平衡，隨之還可能會帶來骨微觀結構的劣變，由此增加骨折的風險。因此，研究微重力環境下誘發骨質丟失的機制并找到相應的對抗策略，對于載人航天具有重要意義。

淫羊藿苷是小檗科淫羊藿屬植物中的一種主要活性成分，對神經系統、骨骼系統、生殖系統、心血管系統都有著良好的藥理作用。目前已有研究證實，淫羊藿苷具有骨保護作用，能夠明顯改善骨質疏松癥狀［4］。同時，在骨代謝過程中淫羊藿苷可發揮雙重作用，不僅可以增加骨形成細胞蛋白的表達，促進骨保護素形成，還可以促進與成骨細胞分化相關因子的表達，從而起到抗骨質疏松的作用［5］。目前探究淫羊藿苷與失重性骨丟失之間關系的研究較少，淫羊藿苷對失重性骨丟失的作用尚不清楚。本研究擬采用尾懸吊模擬失重誘導大鼠骨丟失，測定淫羊藿苷對骨吸收與骨形成相關標志物指標水平及蛋白相對表達量、生物力學參數、骨密度及股骨空間結構的作用，以期為深入研究淫羊藿苷防治失重性骨丟失提供依據。

1 材料

1.1 動物 SPF 級成年雄性SD 大鼠，體質量（200±20） g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司［實驗動物生產許可證號SCXK （京） 2020-0004］，飼養環境溫度 （22±2）℃，相對濕度50%～70%，光照周期12 h／12 h，自由飲食。所有實驗步驟均按照華北理工大學實驗動物中心實驗動物護理和使用指南進行 （倫理號LAEC-NCST-2020050）。

1.2 試劑與藥物 淫羊藿苷（西安圣青生物科技有限公司，純度≥98%，批號YYH2020-5-25）；阿侖膦酸鈉 （杭州默沙東制藥有限公司，純度≥98%，批號 20200522）。骨特異堿性磷酸酶（BALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（Trap）、骨鈣素（OC）、尿鈣（U-Ca）、尿磷（U-P）、肌酐（Cr）、脫氧吡啶啉（DPD）、Ⅰ型膠原的C-末端交聯肽（CTX-Ⅰ）、Ⅰ型膠原的N-末端交聯肽（NTX-Ⅰ）試劑盒 （南京建成生物工程研究所，批號20201008、20201007、20201008、20201010、20201007、20201008、20201008、20201010、20201009）；β-actin、BMP-2、OPG、RANK、RANKL 抗體 （美國R＆D 公司，批號20201201、20201211、20201203、20201205、20201210）。

1.3 儀器 ST16R 型高速冷凍離心機 （美國Thermo Fisher Scientific 公司）；雙能X 線骨密度儀、explore Locus SP 型Micro-CT 掃描儀（美國GE公司）；858 Mini Bionix 型材料測試系統 （美國MTS 公司）；7100 型全自動生化儀［日立高新技術（上海） 國際貿易有限公司］；164-5050 型電泳儀、165-8001 型電泳槽、GelDoc XR 型凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；DYCZ-40D 型轉移槽（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 大鼠隨機分為空白組、模型組、阿侖膦酸鈉組（2.0 mg／kg）、淫羊藿苷組（30 mg／kg），各組灌胃給予相應藥物6 周，第3 周開始除空白組外，其余各組參照Morey-Holton提出的尾懸吊法［6］建立尾懸吊模型，在距大鼠尾根部4 cm 處用克式針平行于冠狀面穿刺于尾骨，克式針兩端彎成環后用回形針將尾部懸于籠頂，使鼠前肢踏于籠底，后肢懸空，身體縱軸與水平面成30°，身體可360°自由旋轉。每個吊籠內懸吊1 只大鼠，空白組大鼠也置于同樣鼠籠中，尾部不懸吊，可自由活動。尾懸吊4 周后全部處死。

2.2 樣品制備 大鼠處死前2 d，禁食12 h，放至代謝籠中收集24 h 尿液，期間禁食，自由飲水。尿液4 ℃、1 200 r／min 離心10 min，吸取上清，于-20 ℃保存備用。實驗結束后，乙醚麻醉大鼠，腹主動脈取全血，4 ℃靜置30 min，4 ℃、2 000 r／min離心20 min，吸取血清［7］，于-80 ℃保存備用。取血后，剝離大鼠股骨，將附著于股骨上的肌肉及組織處理干凈，用浸泡過生理鹽水的紗布將大鼠右側股骨包裹后裝入塑料袋中，置于-20 ℃保存，用以測定大鼠股骨的生物力學性能［8］；左側股骨浸泡于4 ℃的10%福爾馬林中固定，2 d 后保存至4 ℃的70% 乙醇中，用以Micro-CT 掃描分析股骨微結構。

2.3 骨代謝指標檢測 血清和尿液進行解凍，按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清BALP、Trap、OC以及尿液U-Ca、U-P、Cr、DPD、CTX-Ⅰ、NTX-Ⅰ水平［9］。

2.4 股骨骨密度檢測 大鼠處死前3 d，用3%戊巴比妥鈉（0.1 mL／100 g） 腹腔注射麻醉大鼠，四肢展開平置于骨密度儀平臺上，掃描完畢后采用配套軟件對股骨骨密度（BMD） 進行分析［10］。

2.5 股骨生物力學性能檢測 取保存于-20 ℃冰箱中的大鼠右側股骨，放置至室溫，進行三點彎曲實驗。以跨距20 mm，2 mm／min 速率下壓股骨中段，直至股骨發生斷裂，記錄載荷-變形曲線［11］。計算相關生物力學指標，即骨應力、彈性模量、最大載荷、結構硬度及能量吸收。

2.6 股骨形態結構特征檢測 采用Micro-CT 掃描儀沿長軸方向對股骨遠端進行掃描，獲取連續Micro-CT 圖像，圖像分辨率為1 024×1 024，像素點尺寸為20 μm×20 μm，層間距20 μm。掃描完成后，選取生長板下端1.5 mm 處并向下延伸100 個連續片段區域的骨小梁部分為感興趣區域。對感興趣區域進行三維重建，獲取骨小梁三維結構圖像并分析骨小梁如下空間結構參數［12］，即骨組織比例（BV／TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數量（Tb.N）、結構模型指數（SMI） 及骨小梁連接密度（conn.D）。

2.7 分子對接 從PDB 和PubChem 平臺分別獲取靶點（BMP-2、OPG、RANK） 3D 結構和藥物活性成分（阿侖膦酸鈉、淫羊藿苷） 分子結構，通過Schr?dinger Maestro 12.8、Pymol 軟件進行分子對接，分析對接結果與結合能，評估受體與配體的對接情況［13］。

2.8 骨代謝相關蛋白表達檢測 取適量股骨組織勻漿，采用BSA 法進行蛋白定量，蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，再經轉膜、封閉、一抗和二抗孵育、顯影等步驟，根據目的蛋白的分子量選擇內參β-actin，采用Image J 軟件分析各個條帶的灰度值，計算目的蛋白相對表達量［14］。

2.9 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，數據以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 淫羊藿苷對失重大鼠體質量的影響 如圖1所示，在尾懸吊處理前，各組大鼠體質量均呈增加趨勢。從第3 周開始，與空白組比較，模型組和各給藥組大鼠體質量均呈現下降趨勢。實驗結束時，與空白組比較，模型組大鼠體質量均降低 （P＜0.01）；與模型組比較，阿侖膦酸鈉組和淫羊藿苷組大鼠體質量無明顯變化（P＞0.05）。

圖1 6 周內各組大鼠體質量變化（±s，n＝10）Fig．1 Changes of rat body mass in each groupwithin 6 weeks （±s，n＝10）

3.2 淫羊藿苷對失重大鼠骨代謝指標的影響 如表1 所示，與空白組比較，模型組大鼠U-Ca／Cr、U-P／Cr、Trap、DPD、CTX-Ⅰ、NTX-Ⅰ水平均升高（P＜0.01）；BALP、OC 水平均降低 （P＜0.01）。與模型組比較，阿侖膦酸鈉組大鼠U-Ca／Cr、U-P／Cr、Trap、DPD、CTX-Ⅰ、NTX-Ⅰ水平降低（P＜0.05，P＜0.01），BALP、OC 水平無明顯變化（P＞0.05）；淫羊藿苷組U-Ca／Cr、U-P／Cr、Trap、DPD、CTX-Ⅰ、NTX-Ⅰ水平降低（P＜0.05，P＜0.01），BALP、OC 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 淫羊藿苷對失重大鼠骨代謝指標的影響（±s，n＝10）Tab．1 Effects of icariin on bone metabolism indices in weightless rats （±s，n＝10）

表1 淫羊藿苷對失重大鼠骨代謝指標的影響（±s，n＝10）Tab．1 Effects of icariin on bone metabolism indices in weightless rats （±s，n＝10）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別U-Ca／CrU-P／CrBALP／（μg·L-1）Trap／（ng·L-1）OC／（ng·L-1）DPD／（μg·L-1）CTX-Ⅰ／（nmol·L-1）NTX-Ⅰ／（nmol·L-1）空白組0.83±0.12 5.56±0.30 272.92±31.891.88±0.060.24±0.01 234.93±17.354.99±0.2411.87±1.57模型組2.55±0.41** 7.10±0.41** 215.86±23.74** 2.35±0.24** 0.18±0.02** 391.23±15.61** 6.05±0.15** 16.83±1.64**阿侖膦酸鈉組 1.57±0.44＃＃ 6.49±0.54＃ 219.61±25.581.94±0.19＃＃ 0.18±0.02 366.55±16.69＃5.80±0.08＃14.71±1.41＃淫羊藿苷組1.87±0.30＃＃ 6.50±0.50＃ 247.08±21.26＃ 2.08±0.27＃ 0.21±0.02＃＃ 328.66±19.53＃＃ 5.85±0.09＃13.21±1.05＃＃

3.3 淫羊藿苷對失重大鼠骨密度的影響 如圖2所示，與空白組比較，模型組大鼠骨密度降低（P＜0.01）；與模型組比較，阿侖膦酸鈉組和淫羊藿苷組大鼠骨密度均升高（P＜0.01）。

圖2 淫羊藿苷對大鼠股骨骨密度的影響（±s，n＝10）Fig．2 Effects of icariin on femoral bone mineral density in weightless rats （±s，n＝10）

3.4 淫羊藿苷對失重大鼠股骨生物力學性能的影響 如表2 所示，與空白組比較，模型組大鼠股骨生物力學參數骨應力、彈性模量、最大載荷、結構硬度、能量吸收值均降低（P＜0.01）。與模型組比較，阿侖膦酸鈉組大鼠彈性模量及結構硬度水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；淫羊藿苷組大鼠骨應力、彈性模量及最大載荷水平升高 （P＜0.05，P＜0.01）。

表2 淫羊藿苷對失重大鼠股骨生物力學參數的影響（±s，n＝10）Tab．2 Effects of icariin on biomechanical parameters of femur in weightless rats （±s，n＝10）

表2 淫羊藿苷對失重大鼠股骨生物力學參數的影響（±s，n＝10）Tab．2 Effects of icariin on biomechanical parameters of femur in weightless rats （±s，n＝10）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別骨應力／MPa彈性模量／MPa最大載荷／N結構硬度／（N·mm）能量吸收／J空白組89.72±12.223 453.93±222.03112.06±9.62164.54±18.5184.66±5.84模型組64.43±6.32**2 353.06±154.08**74.62±7.65**98.01±15.39**77.65±4.00**阿侖膦酸鈉組63.54±4.672 887.06±174.03＃＃80.47±7.87125.45±17.45＃74.52±3.96淫羊藿苷組75.42±9.30＃3 152.89±206.10＃＃94.36±7.74＃＃97.38±16.5576.42±1.88

3.5 淫羊藿苷對失重大鼠股骨形態結構特征的影響 如圖3 所示，空白組大鼠股骨骨小梁數量較多，排列緊密，質地均勻，股骨皮質骨較厚；模型組大鼠股骨骨小梁數量明顯減少，且出現斷裂現象，網狀結構被破壞，排列無規則，空洞較大，股骨皮質骨明顯變薄；與模型組比較，阿侖膦酸鈉組和淫羊藿苷組大鼠股骨骨小梁數量增加，股骨皮質骨厚度增加，骨小梁連續性好。

圖3 各組大鼠感興趣區域內骨小梁代表圖Fig．3 Representative images of trabecular bone in the region of interest of rats in each group

如表3 所示，與空白組比較，模型組大鼠股骨遠端骨小梁conn.D、BV／TV、Tb.N 和Tb.Th 值均降低（P＜0.05，P＜0.01），SMI 值升高（P＜0.01）。與模型組比較，阿侖膦酸鈉組大鼠conn.D、BV／TV、Tb.N 和Tb.Th 值升高（P＜0.01），SMI 值降低（P＜0.01）；淫羊藿苷組大鼠Conn.D、BV／TV、Tb.N 值升高（P＜0.01），SMI 值降低（P＜0.01）。

表3 淫羊藿苷對失重大鼠股骨遠端微結構影響（±s，n＝10）Tab．3 Effects of icariin on the microstructure of the distal femur in weightless rats （±s，n＝10）

表3 淫羊藿苷對失重大鼠股骨遠端微結構影響（±s，n＝10）Tab．3 Effects of icariin on the microstructure of the distal femur in weightless rats （±s，n＝10）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

組別SMIConn.D／（1·mm-3）BV／TVTb.Th／mmTb.N／（1·mm-1）空白組2.25±0.2239.95±1.880.17±0.030.06±0.022.62±0.25模型組2.84±0.21**0.28±0.08**0.04±0.02**0.04±0.02*0.74±0.10**阿侖膦酸鈉組1.33±0.25＃＃20.59±9.79＃＃0.17±0.05＃＃0.07±0.01＃＃2.17±0.55＃＃淫羊藿苷組2.24±0.43＃＃34.20±8.07＃＃0.20±0.03＃＃0.06±0.022.24±0.15＃＃

3.6 分子對接結果 將藥物作為配體，靶點蛋白作為受體，進行分子對接，結果見圖4，結合評分見表4。結果表明，淫羊藿苷與相關蛋白結合評分較阿侖膦酸鈉更低，與靶點蛋白的匹配度更高，更易發生作用。

表4 阿侖膦酸鈉、淫羊藿苷與相關蛋白分子對接結合評分（kcal／mol）Tab．4 Docking and binding score of alendronate，icariin and related protein molecules （kcal／mol）

圖4 阿侖膦酸鈉、淫羊藿苷與相關蛋白分子對接結果Fig．4 Molecular docking results of alendronate sodium and icariin with related protein molecules

3.7 淫羊藿苷對失重大鼠骨代謝蛋白表達的影響 如圖5 所示，與空白組比較，模型組大鼠股骨組織BMP-2、OPG 蛋白表達降低 （P＜0.01），RANK、RANKL 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，阿侖膦酸鈉組和淫羊藿苷組大鼠股骨組織BMP-2、OPG 蛋白表達升高（P＜0.01），RANK、RANKL 蛋白表達降低（P＜0.01）。

圖5 淫羊藿苷對失重大鼠骨代謝蛋白表達的影響（±s，n＝3）Fig．5 Effects of icariin on the expressions of bone metabolic proteins in weightless rats （±s，n＝3）

4 討論

在微重力環境下，機體骨鈣代謝紊亂，承重骨發生明顯的骨丟失現象并且難以恢復。本研究發現，尾懸吊致失重模型可能會影響大鼠的進食量與代謝，引起大鼠體質量的下降，這一結果也與之前研究結果相似［15］。淫羊藿苷組與阿侖膦酸鈉組大鼠體質量雖高于模型組，但無統計學差異，可見藥物干預不能改善尾懸吊帶來的體質量下降現象。

人體骨骼在正常環境下，成骨細胞承擔的骨形成和破骨細胞承擔的骨吸收處于動態平衡，而在太空微重力環境中，骨骼幾乎完全失去重力作用，會引起骨吸收的增加和骨形成的減少等情況［16］。微重力環境下，身體負重降低，骨吸收增加，使得體內大量鈣、磷流失；成骨細胞分化能力減弱，骨轉換降低，使得BMD 降低。本研究結果顯示，與模型組比較，淫羊藿苷組大鼠骨吸收標志物U-Ca／Cr、U-P／Cr、Trap、DPD、CTX-Ⅰ及NTX-Ⅰ水平降低，骨形成標志物BALP、OC 水平升高，骨代謝指標與BMD 結果均表明，淫羊藿苷可有效改善尾懸吊致失重導致的大鼠骨吸收大于骨形成現象，進而降低骨折發生的風險。

骨力學性能是研究骨組織在外界作用力下的力學特征和受力后的生物學效應，它與骨折風險有直接聯系，是評定骨強度質量的一種可靠方法，也是體現藥物對骨質疏松治療效果最直接、最重要的指標之一［17］。本研究結果顯示，淫羊藿苷不僅可以降低骨轉換率還可以改善骨的力學性能。大鼠生物力學參數的變化表明淫羊藿苷的干預可以使大鼠股骨骨硬度、彈性增加，從而降低骨折的發生機率。

BMP-2 為骨形態發生蛋白2，可誘導成骨細胞分化，而成骨細胞分泌的骨保護素OPG 可與RANKL 競爭性抑制破骨細胞的分化成熟，RANK與RANKL 結合可有效促進破骨細胞分化［18］。研究表明，RANKL／OPG 比值決定了破骨細胞的分化程度［19］，比值降低表明破骨細胞分化受到抑制，骨吸收能力降低。分子對接可直觀表現出藥物與靶點蛋白的結合情況，評分越低代表著藥物與靶點蛋白對接的結合能越低，發生作用的可能性越大。對接結果顯示，相比于阿侖膦酸鈉，淫羊藿苷與骨代謝相關蛋白結合更穩定，匹配程度更高。尾懸吊致大鼠失重打破了骨代謝平衡，導致成骨標志物OPG、BMP-2 表達降低，骨吸收因子RANK 與RANKL 表達升高，RANKL／OPG 比值上調，破骨細胞分化程度加大，從而使得大鼠股骨骨小梁數量減少，連接密度降低，厚度變薄。且對SMI 分析表明，模型組大鼠股骨已形成骨質疏松型結構［20］。

綜上所述，本研究表明淫羊藿苷可在尾懸吊模擬失重條件下抑制破骨細胞活化，促進成骨細胞分化，提高骨轉換率，增加股骨強度，緩解骨吸收大于骨形成現象，從而改善尾懸吊大鼠的骨丟失；淫羊藿苷可有效緩解骨吸收與骨形成的失衡，改善尾懸吊引起的骨丟失現象，該作用機制可能與調控OPG／RANK／RANKL 通路有關。