大蝎子草質量標準及指紋圖譜研究

黎廷楷，鄒 娟，趙旭萍，楊 菁，張敬杰，何 康，孫宜春，李慧馨，劉亞華*

[1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.國藥集團（貴州） 同濟堂制藥有限公司，貴州 貴陽 550009]

大蝎子草Girardiniadiversifolia（Link） Friis 為蕁麻科蝎子草屬多年生草本植物［1］，又名掌葉蝎子草［2］、紅活麻［3］、虎掌蕁麻［4］，主要分布于湖北、四川、貴州、云南等地［5］，可用于治療銀屑病［2］、咳嗽痰多、水腫、瘡毒［5］、丘疹、濕疹、蕁麻疹［6］等疾病。現代研究發現，其含有三萜，甾體，黃酮，揮發油等成分［7-10］，具有抗炎鎮痛［11-13］、抗風濕［14］、抗菌［15］等作用。大蝎子草目前僅在《全國中草藥匯編》［5］中有收載，但僅有其別名、來源、形態特征、生境分布、采集加工、性味功能、主治用法等，缺少TLC 鑒別、含量測定等相關質量控制內容，僅有單獨成分的含量作為質控方法［9］，專屬性差，很難有效控制其質量。因此，為提高其用藥質量，迫切需要對該藥材建立質量標準。

鑒于此，本研究依據2020 年版《中國藥典》及《國家藥品標準工作手冊》 中相關規定對大蝎子草水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物進行研究；并對大蝎子草進行TLC 鑒別，采用HPLC 法建立大蝎子草藥材的指紋圖譜，并對其進行主成分分析及聚類分析，旨在建立大蝎子草的質量標準，以期為大蝎子草藥材的質量控制提供參考依據，以便更好地開發和利用該藥材。

1 材料

LC-2030C 型高效液相色譜儀 （日本島津公司）；Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（美國Agilent 公司）；JA2003 型電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；OSB-2200 型油浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；SHZ-DIII 型循環水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；SK8210HP 型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；高效硅膠G 薄層板（青島海洋化工有限公司）；GZX-9070MBE 型電熱鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；點樣毛細管（上海壘固儀器有限公司）；ZF-7 型暗箱式三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

秦皮素、對羥基肉桂酸、紫云英苷、木犀草素、芹菜素對照品（北京索萊寶科技有限公司，純度≥98%）；東莨菪內酯對照品（成都普思生物科技股份有限公司，純度≥98%）。甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；甲酸（國藥集團化學試劑有限公司）；其余試劑均為分析純；水為純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

大蝎子草來源見表1，經貴州中醫藥大學藥學院吳之坤副教授鑒定來源為蕁麻科蝎子草屬大蝎子草Girardiniadiversifolia（Link） Friis。

表1 樣品信息Tab．1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別 精密稱取大蝎子草粉末4 g，加入95%乙醇50 mL，回流提取2 h，過濾，濾液蒸干，殘渣加入1.5%鹽酸30 mL 超聲溶解，放冷，加石油醚萃取3 次，每次15 mL，棄去石油醚層。再加乙酸乙酯萃取3 次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，加水洗滌至中性，經放有無水硫酸鈉2 g 的濾紙過濾，蒸干，殘渣加入2 mL 乙酸乙酯溶解，作為供試品溶液。取東莨菪內酯對照品適量，配成每1 mL 含有0.02 mg 東莨菪內酯的乙酸乙酯溶液，即為對照品溶液。按照2020 年版《中國藥典》 四部通則0502［16］，分別吸取對照品溶液、供試品溶液各2 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇（6 ∶2 ∶1） 為展開劑，展開，取出，自然晾干，置紫外光燈（365 nm） 下檢視。結果，供試品與對照品在相應位置上顯相同顏色的熒光斑點。見圖1。

圖1 大蝎子草薄層色譜圖Fig．1 TLC chromatograms of G．diversifolia

2.2 水分、灰分、浸出物檢查 采用《中國藥典》 2020 年版第四部通則0832 水分測定法第二法烘干法測定水分；采用通則2302 灰分測定法測定灰分及酸不溶性灰分；采用通則2201 項下水溶性浸出物項熱浸法，以水作溶劑，測定水溶性浸出物［16］。結果見表2。根據測定結果，參考2020 年版《中國藥典》［17］，建議大蝎子草水分為不得過13.0%，總灰分限度不得過21.0%，酸不溶性灰分不得過5.00%，浸出物不得少于14.0%。

表2 大蝎子草的水分、灰分、浸出物含量測定結果（%）Tab．2 Results of content determination for water，ash and extract of G．diversifolia （%）

2.3 溶液制備

2.3.1 對照品溶液 分別精密稱取對羥基肉桂酸、東莨菪內酯、紫云英苷對照品適量，加入甲醇，逐級稀釋得到0.2 mg／mL、0.04 mg／mL、8 μg／mL、1.6 μg／mL、0.32 μg／mL 的對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 取大蝎子草粉末1 g，置100 mL 圓底燒瓶中，加入25 mL 60%甲醇，稱定質量，回流提取60 min，冷卻至室溫，補足減失的質量，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 色譜條件 Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～15 min，5%～8% B；15～45 min，8%～16% B；45～75 min，16%～30% B，75～95 min，30%～47%B；95～100 min，47%B）；體積流量1.2 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長290 nm；進樣量10 μL。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取大蝎子草粉末（S1） 適量，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得各色譜圖的相似度均大于0.98，各共有峰的相對保留時間RSD 小于0.5%，相對峰面積RSD 小于1%，表明儀器精密性良好。

2.5.2 重復性試驗 精密稱定大蝎子草粉末（S1） 6 份，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，測得各色譜圖的相似度均大于0.97，各共有峰的相對保留時間RSD 小于0.4%，相對峰面積RSD 小于2.5%，表明該方法重復性良好。

2.5.3 穩定性試驗 取大蝎子草粉末（S1） 適量，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰的相對保留時間RSD 為0.05%～0.49%，相對峰面積RSD 為0.05%～1.5%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.6 指紋圖譜結果分析

2.6.1 HPLC 指紋圖譜的建立與峰的指認 將13批大大蝎子草粉末按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，記錄HPLC 色譜圖。將各色譜圖以AIA 格式導入相似度軟件，對相關數據進行自動匹配，見圖2，共標定9 個共有峰。以所有樣品共有的1 號色譜峰為參照峰，以其保留時間和峰面積為1。通過與對照品（圖3） 進行比對，指認3 號峰為對羥基肉桂酸，4號峰為東莨菪內酯，6 號峰為紫云英苷。

圖2 大蝎子草HPLC 指紋圖譜Fig．2 HPLC fingerprints of G．diversifolia

圖3 對照品溶液HPLC 色譜圖Fig．3 HPLC chromatograms of reference solutions

2.6.2 相似度評價 設定S1 為參照譜，采用多點校正，時間窗寬度為0.5，中位數法生成對照圖譜，得出各色譜圖的相似度。結果顯示，各批大蝎子草相似度依次為0.916、0.986、0.989、0.985、0.995、0.982、0.994、0.950、0.980、0.971、0.989、0.991、0.991，在0.916～0.995 之間，從大蝎子草指紋圖譜可知，根據產地分布的不同其所含成分有差異，其中貴州省貴陽市黨武鎮龍井村、貴州省六盤水市六枝特區平寨的差異最為明顯。

2.6.3 聚類分析 將13 批大蝎子草指紋圖譜中的9 個共有峰峰面積z-score 標準化。形成13×9 階數據矩陣，導入SPSS 26.0 軟件進行聚類分析，采用組間連接法進行系統聚類分析，聚類結果見圖4。當歐式平方距離為25 時，可分為2 類，S1 （省貴陽市黨武鎮龍井村）、S8 （貴州省六盤水市六枝特區平寨） 聚為一類，其余聚為一類；當歐式平方距離為20 時，可分為3 類，S1、S8 聚為一類、S2～S4 聚為一類，其余聚為一類。

圖4 大蝎子草聚類分析結果Fig．4 Results of cluster analysis for G．diversifolia

2.6.4 主成分分析 將13 批樣品指紋圖譜中的9個共有峰峰面積數據導入SPSS 26.0 軟件進行主成分分析，以特征值＞1 為標準得到3 種主成分，累計方差貢獻率為89.246%，見表3。采用正交性旋轉法，旋轉后的成分矩陣見表4，得分系數矩陣見表5。通過Origin 軟件做主成分分析得分圖，見圖5。由此可知，7～9 號共有峰對主成分1 具有較大的貢獻；2～4 號共有峰對主成分2 具有較大的貢獻，且4 號共有峰與主成分2 呈負相關；1、4、6號共有峰對主成分3 具有較大的貢獻。

圖5 大蝎子草主成分分析得分圖Fig．5 Score diagram of principal compounds analysis for G．diversifolia

表3 大蝎子草主成分特征值及方差貢獻率Tab．3 Principal compounds eigenvalues and variance contribution rates of G．diversifolia

表4 大蝎子草旋轉后的成分矩陣Tab．4 Composition matrix of G．diversifolia after rotation

表5 大蝎子草主成分得分系數矩陣Tab．5 Score coefficient matrix of principal compounds of G．diversifolia

2.6.5 基于主成分分析建立貴州大蝎子草的質量綜合評價模型 由表3、5 可知，選擇Z1、Z2、Z3代表3 種主成分作為13 批大蝎子草所表達的成分信息，建立大蝎子草品質的評價模型，得出3種主成分的關系表達式分別為Z1＝0.001X1-0.029X2-0.012X3-0.104X4+0.238X5+0.115X6+0.245X7+ 0.279X8+ 0.265X9，Z2＝-0.095X1+0.406X2+0.436X3-0.224X4+0.182X5+0.103X6-0.061X7-0.029X8-0.045X9，Z3＝0.427X1-0.030X2-0.149X3+0.341X4+0.193X5+0.371X6-0.059X7+0.058X8。將Z1、Z2、Z3與所對應的方差貢獻率做內積，得到大蝎子草質量綜合評價函數綜合得分 （Z） 的表達式為Z＝（42.916Z1+27.8Z2+18.531Z3）／89.246。貴州不同產地大蝎子草得分值及排序見表6。

表6 大蝎子草得分值及排序Tab．6 Score values and ranking table of G．diversifolia

2.7 含量測定

2.7.1 線性關系考察 取“2.3.1” 項下對照品溶液適量，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，結果見表7，可知各成分線性關系良好。

表7 各成分線性關系Tab．7 Linear relationships of various constituents

2.7.2 精密度試驗 精密稱取大蝎子草粉末（S1） 1 g，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得對羥基肉桂酸、東莨菪內酯、紫云英苷峰面積RSD 分別為0.48%、0.32%、0.17%，表明儀器精密度良好。

2.7.3 穩定性試驗 精密稱取大蝎子草粉末（S1） 1 g，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，測得對羥基肉桂酸、東莨菪內酯、紫云英苷峰面積RSD 分別為1.13%、0.58%、0.31%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.7.4 重復性試驗 精密稱定大蝎子草粉末（S1） 6 份，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，測得對羥基肉桂酸、東莨菪內酯、紫云英苷峰面積RSD 分別為1.59%、0.52%、0.30%，表明該方法重復性良好。

2.7.5 加樣回收率試驗 精密稱定大蝎子草粉末（S1） 6 份，分別加入適量對羥基肉桂酸、東莨菪內酯、紫云英苷對照品，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，對羥基肉桂酸、東莨菪內酯、紫云英苷平均加樣回收率 （RSD） 為101.90% （1.25%）、96.60% （2.13%）、95.10%（2.42%）。

2.7.6 樣品含量測定 取13 批大蝎子草各1 g，按“2.3.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.4”項色譜條件下進樣測定，外標法計算含量，結果見表8。由此可知，對羥基肉桂酸、東莨菪內酯、紫云英苷的平均含量分別為0.060 5、0.021 6、0.124 3 mg／g。結合2020 年版 《中國藥典》［17］，選取含量最高的化學成分紫云英苷做含量限定，即紫云英苷含量不得少于0.01%。

表8 大蝎子草含量測定結果（mg／g）Tab．8 Results of content determination for G．diversifolia（mg／g）

3 討論

3.1 TLC 條件篩選 本研究考察了提取溶劑、純化溶劑、展開劑、點樣量，并且通過薄層板、溫度、濕度、展開劑比例、點樣方式對其耐用性進行考察，同時以對照品與不同批次、同一批次不同展開劑、不同展開比例對專屬性進行考察，結果該方法具有良好的耐用性及專屬性。最終確定了大蝎子草的TLC 展開條件。

3.2 色譜條件的選擇 本研究分別考察了流動相（乙腈-水、甲醇-0.1% 甲酸水、乙腈-0.1% 甲酸水）、檢測波長（254、260、290 nm）、柱溫（25、30、35 ℃）、體積流量（0.8、1.0、1.2 mL／min），結果以乙腈-0.1%甲酸水系統，檢測波長290 nm，體積流量1.2 mL／min，柱溫30 ℃時色譜峰較多，且色譜峰峰形及分離效果較好。

3.3 質量標準起草 本研究對13 批不同產地的大蝎子草進行含量測定，初步擬定大蝎子草水分不得過13.0%，總灰分不得過21.0%，酸不溶性灰分不得過5.0%，水溶性浸出物（熱浸法） 含量不得少于14.0%；并且以東莨菪內酯為對照建立TLC鑒別方法，對照品與雜質分離度良好，供試品色譜與對照品相應位置顯相同的熒光斑點。

3.4 指紋圖譜及含量測定 中藥指紋圖譜是評價中藥最有效的方法之一［18］。本研究對13 批大蝎子草藥材建立指紋圖譜，共確定9 個共有峰，通過與對照品色譜圖進行比對，共確定了3 種成分。并且通過指紋圖譜相似度軟件分析，13 批大蝎子草相似度在0.916～0.995 之間，表明不同地區大蝎子草所含成分存在差異性。聚類分析中，S1、S8 先被分出來聚為一類，其余樣品聚為一類；S2～S4樣品被分出來聚為一類，說明不同地域之間大蝎子草的成分差異較大。課題組從大蝎子草中分離得到了對羥基肉桂酸，紫云英苷、東莨菪內酯等成分，經查閱文獻發現，其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等藥理活性［19-23］。因此，結合大蝎子草的功效，可將上述成分作為指標性成分以控制大蝎子草的質量。結果顯示，對羥基肉桂酸、東莨菪內酯、紫云英苷的平均含量分別為0.060 5、0.021 6、0.124 3 mg／g。結合2020 年版《中國藥典》 最終選取含量最高的化學成分紫云英苷做大蝎子草的含量限定，即紫云英苷含量不得少于0.01%。

4 結論

綜上所述，本研究對大蝎子草藥材進行了薄層色譜鑒別和水分、灰分、浸出物測定，補充完善并且擬定了大蝎子草的質量標準草案，并且利用指紋圖譜數據分析方法結合主成分分析及聚類分析對不同產地大蝎子草藥材進行評價，可為建立大蝎子草藥材整體性質量評價體系提供參考；同時本次研究促進了大蝎子草的質量評價標準的提升，有利于推動其資源的開發與應用。