六安瓜片茶多酚大孔吸附樹脂純化工藝及其降血糖活性研究

劉龍云，何曉梅，趙良冰，李欣冉，王 燕，張珍林，宋銳修

（1.合肥職業技術學院生物工程學院，安徽 合肥 230000；2.皖西學院生物與制藥工程學院，安徽 六安 237012；3.六安市農業技術推廣中心，安徽 六安 237012）

茶葉Camelliasinensis（L.） O.Kuntze 是重要的經濟作物，品類眾多，具有抗氧化、抗炎、抗癌、降血糖、降血脂等作用［1-3］，主要成分為黃烷醇、花色苷、黃酮、黃酮醇、酚酸等［4］。研究表明，多酚類物質是茶葉中的生物活性物質，具有顯著抗氧自由基作用［5-6］，在食品、農業、醫藥等領域有著廣泛應用［7］。隨著人們對茶多酚認識的加深，其市場需求量越來越大，但它主要通過提取純化來獲得，故相關工藝亟需優化改進以滿足產業發展和社會需要。

目前，常用的提取純化方法均存在一些不足［8］，如微波輔助萃取操作可控性較低［9-10］；金屬離子沉淀法會造成重金屬殘留［11］；膜過濾法成本高，規模小［12］。本實驗利用大孔樹脂選擇性吸附的特點［13］來純化茶多酚，有著精準、綠色、高效、安全的特點［14-15］，對制備高純度多酚具有重要意義［16］。

在六大茶類中，綠茶所含茶多酚含量最高［17-18］，六安瓜片作為中國十大名茶中之一的綠茶，是六安市大別山一帶非常重要的經濟作物，故本實驗對其所含的茶多酚進行大孔吸附樹脂純化，并探究其降血糖活性，以期為該品種開發利用提供依據。

1 材料

1.1 儀器 AE124 型電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；RE-52AA 型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；UV-5200 型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；JK-500B 型超聲波清洗器（合肥金尼克醫療科技有限公司）；SHZ-D （Ⅲ） 型循環水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；PHS-25 型PH 計（上海志榮電子科技有限公司）；800A 型粉碎機（永康市紅太陽機電有限公司）；40 目篩（華豐五金儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 血糖試紙（江蘇魚躍醫療設備股份有限公司）。AB-8、NKA-9、LSA-21 型大孔吸附樹脂（東鴻化工有限公司）。鏈脲佐菌素（STZ） （德國BioFroxx 公司）。綠茶茶多酚對照品（上海源葉生物科技有限公司）。酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、焦性沒食子酸（鄰苯三酚）、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、三羥甲基氨基甲烷、檸檬酸、檸檬酸鈉為分析純 （國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 藥材 六安瓜片購自安徽省六安瓜片茶業股份有限公司。

1.4 動物 昆明小鼠，SPF 級，體質量18～22 g，雌雄各半，購于安徽醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK （皖） 2017-001。

2 方法

2.1 提取液制備及茶多酚含量測定

2.1.1 制備方法 稱取六安瓜片2.0 g，粉碎后過40 目篩，置于燒杯中，加入50 mL 70% 乙醇，提取 （溫度70 ℃，功率600 W） 40 min，冷卻至室溫，3 500 r／min 離心10 min，殘渣用50 mL 70%乙醇再提取1 次，合并提取液，在旋轉蒸發儀上濃縮，加水稀釋，即得。

2.1.2 測定方法 采用福林酚比色法［19］測定。稱取沒食子酸對照品0.100 0 g，加水溶解后定容至100 mL，得1 000 μg／mL 母液，分別取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL 至100 mL 量瓶中，制成系列質量濃度，分別取1 mL 至試管中，加入10% 福林酚試劑5.0 mL，避光反應10 min，再加入7.5% Na2CO3溶液4.0 mL，充分混勻，50 ℃水浴10 min，冷卻至室溫，在765 nm 波長處測定吸光度。以對照品質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A） 繪制標準曲線，得方程為A＝0.01X+0.041 7 （R2＝0.999 7），在10～90 μg／mL范圍內線性關系良好，再計算含量，公式為茶多酚含量＝其中V為提取液體積（100 mL），d為稀釋因子（1 mL 稀釋至100 mL，則其稀釋因子為100），SLOPESted為標準曲線斜率，m為樣品質量。

2.2 分離純化工藝研究

2.2.1 大孔吸附樹脂篩選 稱取等量AB-8、NKA-9、LSA-21 型樹脂，置于無水乙醇中浸泡24 h，去離子水洗滌至無醇味，置于5%鹽酸中浸泡24 h，去離子水洗至中性，置于5%NaOH 溶液中浸泡24 h，去離子水洗至中性，最后加入去離子水。分別稱取3.0 g （濕重） 至100 mL 錐形瓶中，加入20 mL 提取液，保鮮膜密封，恒溫（25 ℃）、100 r／min 振蕩24 h，靜置后過濾，按“2.1.2” 項方法測定茶多酚含量，再計算吸附量、吸附率，公式分別為吸附量＝、吸附率＝×100%，其中m為樹脂質量，C0為提取液中茶多酚含量，C1為吸附液中茶多酚含量，V1為吸附液體積。

將吸附飽和的3 種樹脂用一定體積去離子水沖洗，置于100 mL 錐形瓶中，加入80%乙醇20 mL，保鮮膜密封，恒溫（25 ℃）、100 r／min 振蕩24 h，靜置后抽濾，按“2.1.2” 項下方法測定茶多酚含量，計算解吸率，公式為解吸率＝×100%，其中C0為提取液中茶多酚含量，C1為吸附液中茶多酚含量，C2為解吸液中茶多酚含量，V1為吸附液體積，V2為解吸液體積。

2.2.2 靜態吸附工藝優化

2.2.2.1 單因素試驗 （1） 吸附時間：取預處理好的AB-8 型樹脂3.0 g （濕重），轉移至100 mL 錐形瓶中，加入20 mL 提取液（pH 值為6.0，含3.343 mg／mL 茶多酚），在25 ℃下吸附，每30 min 測定上清液中茶多酚含量，按“2.2.1” 項下方法計算吸附量。

（2） 吸附溫度：取預處理好的AB-8 型樹脂3.0 g （濕重），平行5 份，轉移至100 mL 錐形瓶中，加入20 mL 提取液（pH 值為6.0，含2.866 mg／mL 茶多酚），分別在20、25、30、35、40 ℃下吸附2 h，測定上清液中茶多酚含量，按“2.2.1” 項下方法計算吸附量。

（3） 吸附pH 值：取預處理好的AB-8 型樹脂3.0 g（濕重），平行7 份，轉移至100 mL 錐形瓶中，加入20 mL提取液（含3.188 mg／mL 茶多酚），采用同體積酸堿試劑分別調節pH 值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在25 ℃下吸附2 h，測定上清液中茶多酚含量，按“2.2.1” 項下方法計算吸附量。

2.2.2.2 正交試驗 在單因素試驗基礎上，以吸附時間（A）、吸附溫度（B）、吸附pH 值（C） 為影響因素，茶多酚吸附量為評價指標，設計L9（33） 正交表，因素水平見表1。

表1 靜態吸附正交試驗因素水平

2.2.3 靜態解吸工藝優化

2.2.3.1 單因素試驗 （1） 解吸時間：取吸附飽和的AB-8 型樹脂3.0 g，去離子水沖洗除去表面殘留液，抽濾后置于100 mL 錐形瓶中，加入20 mL 80%乙醇，在25 ℃下解吸，每30 min 測定上清液中茶多酚含量至解吸結束，測定解吸平衡液吸光度，按“2.2.1” 項下方法計算解吸率。

（2） 乙醇體積分數：取吸附飽和的AB-8 型樹脂3.0 g，去離子水沖洗除去表面殘留液，抽濾后置于100 mL 錐形瓶中，分別加入40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇各20 mL，在25 ℃下解吸2 h，測定解吸平衡液吸光度，按“2.2.1” 項下方法計算解吸率。

（3） 解吸溫度：取吸附飽和的AB-8 型樹脂3.0 g，去離子水沖洗除去表面殘留液，抽濾后置于100 mL 錐形瓶中，加入20 mL 70% 乙醇，分別在20、25、30、35、40、45 ℃下解吸2 h，測定解吸平衡液吸光度，按“2.2.1” 項下方法計算解吸率。

2.2.3.2 正交試驗 在單因素試驗基礎上，以解吸時間（A）、解吸溫度（B）、乙醇體積分數（C） 為影響因素，茶多酚解吸率為評價指標，設計L9（33） 正交表，因素水平見表2。

表2 靜態解吸正交試驗因素水平

2.3 茶多酚純度測定 將解吸后的樹脂進行抽濾，收集濾液，適當濃縮后冷凍干燥，再分別制備50 μg／mL 對照品、純化后樣品溶液，在紫外-可見光譜下測定吸光度，計算純度。

2.4 降血糖活性研究 60 只小鼠隨機分為6 組，每組10只，分別為空白組、模型組、對照組、茶多酚低劑量組、茶多酚中劑量組、茶多酚高劑量組［20］，適應性喂養3 d 后禁食不禁水12 h，除空白組外各組小鼠以0.1 mL／10 g 劑量腹腔注射1%鏈脲佐菌素，而空白組小鼠腹腔注射等劑量檸檬酸緩沖液［21］，尾部取血，檢測血糖值，以大于11 mmol／L為造模成功?？瞻捉M、模型組小鼠灌胃給予蒸餾水，對照組小鼠灌胃給予600 mg／kg 綠茶茶多酚對照品溶液，茶多酚低、中、高劑量組小鼠分別灌胃給予“2.1” 項下300、600、1 200 mg／kg 提取液，劑量均為0.1 mL／10 g，連續30 d，每3 d 稱定1 次體質量，最后1 次給藥后禁食，血糖監測儀檢測血糖值，計算血糖下降率［22］，公式為血糖下降率＝小鼠脫臼處死，取心、肝、脾、腎、胸腺，稱定質量，計算臟器指數［23］，公式為臟器指數＝

2.5 數據處理 采用Excel 軟件進行處理，結果以（±s）表示。

3 結果

3.1 樹脂篩選 由表3 可知，各樹脂吸附能力依次為AB-8、LSA、NKA，解吸能力依次為AB-8、LSA、NKA-9，故選擇AB-8 型樹脂進行后續研究。

表3 不同大孔吸附樹脂吸附、解吸能力比較

3.2 靜態吸附工藝優化

3.2.1 單因素試驗 由圖1A 可知，茶多酚吸附量隨著吸附時間延長先升高，2 h 后趨緩，表明吸附2 h 時已接近飽和，故以其為最佳吸附時間。

圖1 靜態吸附工藝單因素試驗結果

由圖1B 可知，茶多酚吸附量隨著吸附溫度增加先升高，在25 ℃時達到最大值，但繼續增加時反而降低，這是因為當溫度適當升高時分子運動速度加快，有利于樹脂吸附；當溫度進一步升高時可能會使得茶多酚與空氣接觸加劇而發生氧化反應，導致其含量降低，故以25 ℃為最佳吸附溫度。

由圖1C 可知，茶多酚吸附量隨著吸附pH 值增加先升高，在4.0 時達到最大值，這是因為多酚類化合物含有較多羥基而容易電離出H+，從而呈弱酸性，如果抑制H+電離并保證該成分以分子形式存在，則有利于吸附；但繼續增加時多酚離子化程度會加深，吸附效果降低，導致純化效率反而下降，故以4.0 為最佳吸附pH 值。

3.2.2 正交試驗 因素水平見表4，結果見表5，可知各因素影響程度依次為B＞C＞A，最優工藝為A3B2C2，為了節約時間和成本，本實驗選擇吸附時間為2 h。最終確定，最優工藝為吸附時間2 h，吸附溫度25 ℃，吸附pH 值4.0。

表4 靜態吸附工藝正交試驗設計與結果

表5 靜態吸附工藝正交試驗方差分析

3.2.3 驗證試驗 按“3.2.2” 項下優化工藝進行3 批驗證試驗，測得茶多酚平均吸附量為15.25 mg／g，表明該工藝穩定可行。

3.3 靜態解吸工藝

3.3.1 單因素試驗 由圖2A 可知，茶多酚解吸率隨著解吸時間延長升高，在120 min 時達到最大值，但繼續延長時反而略微降低，其原因可能是解吸出的茶多酚又重新吸附到樹脂上，故以120 min 為最佳解吸時間。

圖2 靜態解吸工藝單因素試驗結果

由圖2B 可知，茶多酚解吸率隨著乙醇體積分數增加升高，在70%時達到最大值，但繼續增加時有降低趨勢，故以70%為最佳乙醇體積分數。

由圖2C 可知，茶多酚解吸率隨著解吸溫度增加升高，在35 ℃時達到最大值，但繼續升高時反而降低，其原因可能是樹脂內部分子運動隨著溫度增加先越來越活躍，使茶多酚更易被乙醇洗脫下來，但溫度過高時樹脂容易變性，乙醇容易揮發，導致解吸效果下降，故以35 ℃為最佳解吸溫度。

3.3.2 正交試驗 因素水平見表6，結果見表7，可知各因素影響程度依次為C＞A＞B，最優工藝為A1B2C2，即解吸時間1.5 h，解吸溫度35 ℃，乙醇體積分數70%。

表6 靜態解吸工藝正交試驗結果

表7 解吸工藝正交試驗方差分析

3.3.3 驗證試驗 按“3.3.2” 項下優化工藝進行3 批驗證試驗，測得茶多酚平均解吸率達84.91%，表明該工藝穩定可行。

3.4 茶多酚純度測定 按“3.2.2” “3.3.2” 項下優化工藝純化茶多酚，測得其純度為78.64%。

3.4.1 血糖值 由表8 可知，與空白組比較，模型組小鼠血糖值升高（P＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，茶多酚各劑量組小鼠血糖值降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性。

表8 各組小鼠血糖值比較（±s，n＝10）

表8 各組小鼠血糖值比較（±s，n＝10）

注：與空白組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別實驗前血糖值／（mmol·L-1）實驗后血糖值／（mmol·L-1）血糖下降率／%空白組7.50±0.596.81±0.939模型組16.10±3.60**19.00±2.10**-18對照組17.94±5.905.60±0.80＃＃69茶多酚低劑量組 15.54±3.589.10±1.14＃41茶多酚中劑量組 11.40±2.015.20±0.77＃＃54茶多酚高劑量組 15.33±5.063.30±0.84＃＃78

3.4.2 臟器指數 除空白組外，各組小鼠在實驗開始時均會出現眼部細菌感染，灌胃給藥一段時間后除模型組外均有所減輕。由表9 可知，與模型組比較，茶多酚各劑量組小鼠臟器指數均有不同程度的改善，以中劑量組更全面（P＜0.05，P＜0.01）。

表9 各組小鼠臟器指數比較（mg／g，±s，n＝10）

表9 各組小鼠臟器指數比較（mg／g，±s，n＝10）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

組別心肝脾腎胸腺空白組0.565±0.0784.848±0.4380.531±0.1781.516±0.1740.441±0.177模型組0.510±0.066*4.847±0.4140.504±0.1861.576±0.201*0.536±0.245*對照組0.516±0.1035.151±0.8330.659±0.348＃1.679±0.215＃0.232±0.101＃＃茶多酚低劑量組0.596±0.013＃4.826±0.3120.793±0.158＃＃1.442±0.1560.347±0.096＃＃茶多酚中劑量組0.603±0.080＃＃4.290±0.358＃0.373±0.128＃1.328±0.151＃0.362±0.101＃＃茶多酚高劑量組0.498±0.0384.751±0.8350.403±0.060＃1.466±0.1660.226±0.037＃＃

4 討論與結論

本實驗在單因素試驗基礎上采用正交試驗，得到AB-8型大孔吸附樹脂純化六安瓜片茶多酚的最優靜態吸附工藝為溫度25 ℃，pH 值4.0，吸附時間2 h，吸附量達15.25 mg／g；最優靜態解吸工藝為解吸時間1.5 h，解吸溫度35 ℃，乙醇體積分數70%，解吸率達84.91%，并且工藝環境友好，設備可靠，過程安全，經濟有效，便于產業化。再進行3 批驗證試驗，發現上述工藝穩定可靠。

綠茶作為藥食同源、食用更廣的品種，其用量與藥效的關系是研發中非常重要的參數。因此，本實驗以鏈脲佐菌素建立高血糖小鼠模型，考察茶多酚對其血糖、臟器指數的影響，發現不同劑量該成分均能顯著降低血糖，并且呈現劑量依賴性，并且中劑量組對臟器指數的影響更全面。上述結果可為其他茶葉產品的開發提供理論依據。