舒肝利膽濃縮丸提取工藝優化

李俊江，徐志偉，畢映燕，李季文，楊小源

（甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730000）

慢性膽囊炎是臨床常見慢性膽道系統疾病之一，主要癥狀包括惡心、腹脹、嘔吐、噯氣、厭食油膩、右上腹反復疼痛等［1］，西醫治療重在緩解炎癥、促進排石，效果明顯但難以根治，同時伴有較多副作用［2-3］。中醫認為，慢性膽囊炎屬“膽脹” “脅痛” 范疇［4］，若膽氣不降、臟腑郁滯不通則易誘發膽腑脹滿、疼痛等諸多不適癥狀［5］，治療時側重疏肝理氣、通腑利膽。

舒肝利膽方為甘肅省中醫院協定方，由醋柴胡、金錢草、白豆蔻、荊芥等13 味中藥組成，具有疏肝理氣、清熱祛濕、利膽止痛功效，臨床上治療慢性膽囊炎多年。為了促進舒肝利膽方臨床使用范圍，更好地服務于患者，本實驗擬將該方制成臨床療效顯著、丸劑載藥量多、穩定性好、服用方便的濃縮丸。

CRITIC-AHP 復合加權法綜合了層次分析法（AHP）、基于指標相關性的權重確定方法（CRITIC） 的優越性，既可保持權重稀釋的穩定性，又能較好地區分數據信息［6］。因此，本實驗采用該方法結合Box-Behnken 響應面法優化舒肝利膽濃縮丸提取工藝。

1 材料

1.1 儀器 A-10 型高效液相色譜儀（美國PerkinElmer 公司）；LX2200C 型（0.01 g）、LX120A 型（0.000 1 g） 電子分析天平（瑞士普利賽斯公司）；HWS26 型電熱恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司）；HXGZ-000800 型電熱恒溫干燥箱、KQZ3200E 型超聲波清洗機（連云港醫療器械設備廠）。

1.2 試劑與藥物 柴胡、金錢草、豆蔻、紫蘇子、白芥子、甘草、大棗、干姜等藥材均購自甘肅康樂藥業有限責任公司，經甘肅省中醫院楊小源主任中藥師鑒定為正品，符合2020 年版《中國藥典》 一部規定。甘草苷 （批號111610-201607）、迷迭香酸（批號111871-201706）、橙皮苷（批號110721-201818）、槲皮素（批號100081-201610）、柴胡皂苷a （批號20736-09-8） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院（純度≥98%）。甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 指標成分含量測定 采用HPLC 法。

2.1.1 供試品溶液制備 精密量取提取液10 mL，蒸干，甲醇定容至25 mL 量瓶中，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，甲醇定容至10 mL 量瓶中，搖勻，即得（各成分質量濃度分別為甘草苷2.16 mg／mL、迷迭香酸4.12 mg／mL、橙皮苷2.05 mg／mL、槲皮素0.08 mg／mL、柴胡皂苷a 2.12 mg／mL）。

2.1.3 陰性樣品溶液制備 按本品處方比例，制成缺甘草、紫蘇子、枳殼、金錢草、柴胡的陰性樣品，按“2.1.1” 項下方法制備，即得。

2.1.4 色譜條件 Waters Symmetry Shield RP-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），DAD 檢測器；流動相乙腈（A）-0.1% 磷酸 （B），梯度洗脫 （0～12 min，17% A；12～18 min，17%～22%A；18～24 min，22%～30%A；24～32 min，30%～38% A；32～45 min，38%～80% A；45～55 min，80%～17%A）；體積流量1 mL／min；柱溫20 ℃；檢測波長0～18 min 237 nm，18～24 min 283 nm，24～28 min 330 nm，28～35 min 368 nm，35～55 min 210 nm；進樣量10 μL。

2.1.5 系統適用性考察 精密量取對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.1.4” 項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分色譜峰分離度良好，陰性無干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.1.6 線性關系考察 精密吸取“2.1.2” 項下對照品溶液適量，稀釋成6 個質量濃度，在“2.1.4” 項色譜條件下各進樣測定10 μL。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸，得方程分別為甘草苷Y＝0.401 2X-0.287 7，線性范圍0.216 1～2.160 3 mg／g；迷迭香酸Y＝1.913 6X-1.370 4，線性范圍1.036 6～10.311 6 mg／g；橙皮苷Y＝0.380 8X-0.270 1，線性范圍0.205 4～2.053 2 mg／g；槲皮素Y＝0.001 5X-0.000 8，線性范圍0.000 8～0.008 1 mg／g；柴胡皂苷aY＝1.182X-0.853 4，線性范圍0.636 6～6.363 1 mg／g。

2.1.7 精密度試驗 精密量取同一份供試品溶液10 μL，同一天內在“2.1.4” 項色譜條件下進樣測定6 次，計算日內精密度；隔天取置于冰箱中冷藏的同一份供試品溶液適量，連續2 d 在“2.1.4” 項色譜條件下進樣測定，每天3次，計算日間精密度，測得甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 日內精密度RSD 分別為1.03%、1.01%、1.02%、1.05%、1.03%，日間精密度RSD 分別為1.11%、1.13%、1.16%、1.07%、1.09%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復性試驗 取同一份本品，按“2.1.1” 項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.4” 項色譜條件下進樣測定，測得甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量RSD 分別為1.33%、0.51%、1.37%、0.69%、1.17%，表明該方法重復性良好。

2.1.9 穩定性試驗 取同一份供試品溶液適量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.4” 項色譜條件下進樣測定，測得甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 峰面積RSD 分別為1.38%、1.04%、0.22%、1.41%、0.71%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗 精密稱取各成分含量已知的供試品溶液9 份，隨機分為3 組，分別精密加入80%、100%、120%水平對照品溶液，在“2.1.4” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 平均加樣回收率分別為101.14%、98.92%、101.15%、99.51%、99.98%，RSD 分別為0.12%、0.76%、1.10%、1.02%、0.54%。

2.2 干浸膏得率測定 精密量取按最優工藝提取的供試品溶液10 mL，置于干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，在105 ℃下干燥3 h，置于干燥器中冷卻，精密稱定質量，計算得率。

2.3 單因素試驗

2.3.1 浸泡時間 按處方比例平行稱取藥材6 份，加10倍量水分別浸泡0～240 min 后提取90 min，濃縮至70 mL，測定甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量及干浸膏得率。最終，分別選擇30、60 min 作為后續優化研究中的最低、最高水平值。

2.3.2 提取時間 按處方比例平行稱取藥材6 份，加10倍量水，以30 min 為節點分別提取0～180 min，濃縮至70 mL，測定甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量及干浸膏得率。最終，分別選擇60、120 min 作為后續優化研究中的最低、最高水平值。

2.3.3 提取次數 按處方比例平行稱取藥材6 份，加10倍量水分別提取1、2、3 次，每次90 min，將提取2 次以上者濃縮至70 mL，測定甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量及干浸膏得率。結果，提取3 次時各成分含量最高，并與提取1、2 次時相比有明顯差異，故最終選擇3 次，并不再進行優化。

2.3.4 加液量 按處方比例平行稱取藥材6 份，分別加入6～16 倍量水提取60 min，濃縮至70 mL，測定甘草苷、迷迭香酸、橙皮苷、槲皮素、柴胡皂苷a 含量及干浸膏得率。最終，分別選擇8、12 倍作為后續優化研究中的最低、最高水平值。

2.4 指標權重確定 參考文獻［7-9］ 報道。

2.4.1 CRITIC 法 該方法以標準差σj體現對比強度，指標間相關性Rj體現沖突性，公式為其中rij表示評價指標i、j之間的相關系數；Cj表示第j個指標的信息量，公式為Cj＝＝σjRf（j＝1，2，3，4，5，6，7，…），其數值越大，第j個指標信息量、相對重要性也越大，客觀權重Wj公式為Wj＝

以公式指標成分值＝［（實測值-最小值）／（最大值-最小值）］ ×100 計算對比強度（σj）、沖突性（Rj）、綜合權重（Cj）、客觀權重（Wj），得柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量及干浸膏得率客觀權重分別為0.142 5、0.209 4、0.142 7、0.123 2、0.193 6、0.188 6。

2.4.2 AHP 法 綜合考慮藥味配伍規律、含量、藥理作用等方面，以量化的柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量及干浸膏得率為權重指標，分成6 個層次，依次為柴胡皂苷a 含量、槲皮素含量、迷迭香酸含量、橙皮苷含量、甘草苷含量、干浸膏得率，構建成對比較的優先判斷矩陣，見表1。

表1 各指標成對比較的優先判斷矩陣

最終，經層次分析后柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量及干浸膏得率權重系數分別為0.380 6、0.251 6、0.160 2、0.100 9、0.064 3、0.042 5，一致性比列因子（CR）＝0.02＜0.10，即各指標優先判斷矩陣的一致性均符合要求。

2.4.3 CRITIC-AHP 復合加權法 在“2.4.1” “2.4.2” 項下結果基礎上計算復合權重ω復合ij，公式為ω復合ij＝ωAHPij ωCRITICij／∑ωAHPijωCRITICij，得柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量及干浸膏得率復合權重分別為0.333 4、0.323 9、0.140 5、0.076 4、0.076 5、0.049 3。

2.5 Box-Behnken 響應面法 在單因素試驗基礎上，以浸泡時間（A）、提取時間（B）、加液量（C） 為影響因素，柴胡皂苷a （Y1）、槲皮素（Y2）、迷迭香酸（Y3）、橙皮苷（Y4）、甘草苷（Y5） 含量及干浸膏得率（YG） 為評價指標，按“2.4.4” 項下方法計算綜合評分 （Y），結果見表2。

表2 試驗設計與結果

采用Design-Expert 8.0.6.1 軟件進行二次多元回歸擬合，得方程為Y＝81.62+20.15A-0.12B-15.69C+6.43AB+8.53AC+19.71BC-21.29A2+2.23B2-16.82C2，相關系數為0.996 9，校正系數為0.990 8，表明模型擬合度好，試驗誤差小，方差分析見表3。由此可知，各因素影響程度依次為浸泡時間（A） ＞加液量（C） ＞提取時間（B），響應面分析見圖2。最終確定，最優工藝為藥材浸泡45 min 后加10倍量水提取3 次，每次90 min。

表3 方差分析

圖2 各因素響應面圖

2.6 綜合評分比較 分別采用CRITIC 法、AHP 法、CRITIC-AHP 復合加權法計算權重系數，并對其進行綜合評分，結果見表4。再計算相關系數，得CRITIC 法、AHP 法該數值為0.952，CRITIC 法、CRITIC-AHP 復合加權法該數值為0.946，AHP 法、CRITIC-AHP 復合加權法該數值為0.999，表明3 種方法有顯著相關性（P＜0.05），評分具有一致性；CRITIC 法、AHP 法該數值為0.178，無顯著相關性（P＞0.05），表明所反映的信息不具有疊加性。

表4 各方法所得綜合評分（分）

2.7 驗證試驗 按處方比例平行稱取藥材6 份，按“2.5”項優化工藝進行3 批驗證試驗，測得綜合評分分別為98.91、99.02、98.88 分，平均值為98.94 分，RSD 為0.074 5%，表明該工藝穩定可行。

3 討論

3.1 評價指標選擇 舒肝利膽濃縮丸中主要成分均為對應藥味的2020 年版《中國藥典》 檢測指標或重要活性物質，其中柴胡皂苷a 具有抗腫瘤、抗肝毒、抗病毒、抗高血脂、抗內毒素、抗過敏、抗細胞黏附等作用［10］；槲皮素具有降低血壓、增強毛細血管抵抗力、減少毛細血管脆性等作用［11］；迷迭香酸具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等活性［12］；橙皮苷可降低毛細血管脆性，增強毛細血管韌性［13］；甘草苷具有抗氧化、抗衰老、抗纖維化、抗哮喘、抗肝損傷、抗肝癌作用［14］。因此，本實驗選擇上述成分進行含量測定。

3.2 權重系數計算方法選擇 CRITIC 法是利用評價指標本身標準偏差和相關系數來綜合衡量相關權重的客觀賦權方法，雖然所得權重系數受人為因素影響較少，但指標之間的輕重關系易忽視。AHP 是基于層次分析結合數學邏輯思維來分析多個目標信息，計算相對于上一層信息的本層信息權重比例的主觀賦權方法，但其所得權重系數主觀性較強，而且易忽視評價指標本身的客觀數據信息。CRITICAHP 復合加權法結合上述2 種方法優勢，既可保持權重系數的穩定性，又能較好地區分數據信息，本實驗采用該方法優化舒肝利膽濃縮丸提取工藝，其簡便可行，質量穩定，可為該制劑后期制備提供參考［15-16］。