UPLC-Q-TOF-MS／MS 法結合網絡藥理學研究滇重樓抗肺癌活性成分

楊遠貴，李 凡，許洪波，周新朋，衛培峰，唐志書，5*

[1.陜西中醫藥大學，陜西省中藥資源產業化協同創新中心，秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室（培育），陜西 咸陽 712046；2.陜西國際商貿學院，陜西 咸陽 712046；3.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014；4.陜西中醫藥大學第二附屬醫院，陜西 咸陽 712000；5.中國中醫科學院，北京 100700]

肺癌是癌癥相關疾病死亡的主要原因，統計發現肺癌占癌癥死亡的19.4%［1］。目前，化療是治療肺癌病人的主要手段［2］，為提高肺癌患者的生活質量和生存期，亟待開發新的肺癌治療藥物。重樓具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效［3］，可用于治療鼻咽癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、子宮肌瘤、白血病等［4］。研究發現，重樓皂苷Ⅰ、Ⅶ可有效抑制NSCLC 細胞系A549 的增殖、轉移［5］，誘導細胞凋亡［6］。

網絡藥理學與傳統藥理學不同，從系統和整體角度研究藥物、靶點、疾病，更能符合中藥的整體觀，其用于中藥的研究具有獨特的優勢［7-8］。Wang 等［9］采用LC-MS 法和網絡藥理學研究毛茛抗類風濕性關節炎的藥效物質基礎及其分子機制，共發現9 種活性成分是毛茛化合物-靶點-通路中的關鍵節點，采用類風濕關節炎滑膜成纖維細胞進行驗證，結果表明小檗堿和甲氧醉椒素具有抗類風濕關節炎的作用。

針對重樓抗肺癌藥效物質及作用機制存在的問題，本研究以重樓為研究對象，采用UPLC-Q-TOF-MS／MS 法對重樓中化學成分進行整體表征，結合網絡藥理學辨識重樓抗肺癌的活性成分，分析重樓抗肺癌活性關鍵靶點和作用機制，探討其藥效物質基礎，為質量控制的提升提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Shimadzu LC-30A 高效液相色譜儀，串聯飛行時間質譜儀，配有LC-30A 二元液相泵、SIL-30AC 自動進樣器、CTO-20AC 柱溫箱（日本Shimazdzu 公司）；KQ5200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius BSA 124S-CW 電子分析天平［萬分之一，賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司］；Eppendorf 5424R 離心機 （德國Eppendorf 公司）；S0200-230V 渦旋混合儀（深圳市賽泰克生物科技有限公司）；Milli-Q 超純水系統（美國Millipore公司）。

1.2 試劑與藥物 重樓為云南省麗江市5 年生滇重樓，由云南省農業科學院藥用植物所王元忠副研究員鑒定為正品。重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ對照品購自成都普瑞法科技開發有限公司；重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷Ⅲ購自成都曼思特生物科技有限公司。甲酸、乙腈、甲醇為色譜純，購自美國賽默飛世爾公司；甲醇為分析純，購自國藥集團上海有限公司。

2 方法

2.1 UPLC-Q-TOF-MS／MS 條件

2.1.1 色譜 ACQUITY UPLCTM HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，19% B；5～15 min，19%～28% B；15～25 min，28%～40% B；25～35.5 min，40%～95% B；35.5～40 min，95%B；40～42 min，19%B）；體積流量0.3 mL／min；進樣量2 μL。

2.1.2 質譜 電噴霧（ESI） 離子源；負離子模式；氣簾氣35 psi （1 psi＝6.895 kPa）；離子化電壓4 500 V；加熱模塊溫度500 ℃；噴霧氣55 psi；輔助加熱氣50 psi；碰撞電壓20～60 V；質譜掃描范圍m／z100～1 500。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取重樓皂苷Ⅰ（5.01 mg）、重樓皂苷Ⅱ（5.42 mg）、重樓皂苷Ⅲ（5.23 mg）、重樓皂苷Ⅴ（5.64 mg）、重樓皂苷Ⅵ（5.26 mg）、重樓皂苷Ⅶ（5.48 mg），溶于5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備 稱取滇重樓粉末（過4 號篩）1.003 g，精密稱定，置于100 mL 錐形瓶中，加入25 mL 70%甲醇，稱定質量，超聲處理（功率250 W、頻率100 kHz） 50 min，靜置，補足減失的質量，過濾，取續濾液，即得。

2.4 化合物結構解析 整理重樓化學成分數據庫，將包含化合物名稱、分子量、分子式、代表性碎片、化合物藥用部位表格導入到LibraryView 中建立重樓化學成分數據庫。打開MasterView，將樣品數據導入，與已建立的數據庫進行質譜數據匹配，并進行結果分析，將匹配程度較高（結果列表中顯示綠色高亮的化合物） 導出。結合數據庫匹配、對照品比對、樣品質譜裂解碎片、文獻數據比對、化合物結構組成等相關信息，對滇重樓色譜峰進行定性鑒別。

2.5 網絡藥理學分析

2.5.1 重樓化學成分-靶點預測 將重樓提取物表征出來的化合物，采用 Chemspider 數據庫 （http：／／www.chemspider.com／Default.aspx），查詢活性成分的Canonical SMILES 字符串；將查詢到的字符串輸入到Swiss Target Prediction 數據庫（http：／／www.swisstargetprediction.ch／），從而獲得每個成分的潛在靶點。以“lung cancer”為關鍵詞進行檢索，以相關性分數（Relevance score＞20）作為篩選條件，得到肺癌的相關靶點。利用網絡平臺繪制韋恩圖 （http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn） 獲得成分和疾病的共有靶點。

2.5.2 蛋白-蛋白互作網絡構建 運用Cytoscape 3.7.2 軟件構建成分靶點網絡，以節點表示化合物靶蛋白，邊表示化合物-靶點的相互作用，并篩選出靶點數靠前的成分作為重樓治療肺癌的有效成分。將靶點輸入String 數據庫，物種選擇“Homosapiens”，以Combined score＞0.9 作為篩選條件，得到PPI 網絡圖，并篩選出治療肺癌的關鍵靶點。采用DAVID 6.8 數據庫對治療肺癌的關鍵靶點進行GO 和KEGG 分析。將KEGG 篩選排名靠前的與抗肺癌相關的信號通路，與重樓活性成分、作用靶點一一對應，構建“成分-靶點-通路” 多維網絡圖。

3 結果

3.1 重樓化學成分分析 總離子流圖見圖1，滇重樓化合物鑒定見表1。化合物主要以去質子化離子［M-H］-和醋酸根加合離子［M+HCOO］-離子化形式存在。裂解主要以化合物母核與糖鏈裂解為主。滇重樓提取物共鑒定出26 個化合物，包括17 個異螺甾烷醇型（9 個薯蕷皂苷型和8 個偏諾皂苷型）、1 個螺甾烷醇型、1 個C21 甾體化合物、2個黃酮類、1 個其他類型。

表1 滇重樓化合物鑒定

圖1 滇重樓總離子流圖

3.1.1 異螺甾烷醇型 異螺甾烷醇型為重樓皂苷的主要類型，包括薯蕷皂苷型、偏諾皂苷型，17β 位有羥基取代為偏諾皂苷型。該類型化合物一般在5、6 位有雙鍵，3β、7β 有羥基取代，3 位與D-葡萄糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖等糖鏈，發生成苷反應。峰2～3、6、13～15、18～19 為偏諾皂苷型。以峰6 和18 為例，進行化合物解析。負離子模式下，峰6 的甲酸根加合離子為m／z1 107.496 0 ［M+HCOO］-，分子離子m／z1 061.489 9 ［M-H］-失去一分子木糖得到碎片離子m／z929.447 0，失去一分子鼠李糖和1個羥基基團得到碎片離子m／z765.373 6，斷裂一分子夫糖生成碎片離子m／z619.310 3，失去一分子葡萄糖生成碎片離子m／z439.253 2，得到1 個不含糖鏈的母核結構，根據化合物結構和質譜裂解碎片，推測峰6 為parisyunnanoside H，質譜圖見圖2。峰18 分子離子m／z1 029.534 2，連續失去3 個鼠李糖，分別得到碎片離子m／z883.967 2、737.416 3、591.985 8，失去一分子葡萄糖得到碎片離子m／z429.136 3，結合化合物結構、碎片離子、對照品比對，推測峰18 為重樓皂苷Ⅶ。

圖2 峰6 一級（A）、二級（B） 質譜圖

根據化合物質譜裂解信息，峰7、9～11、22～24 為薯蕷皂苷型。以峰22、24 為例，進行化合物解析。負離子模式下，峰22 分子離子為m／z1 013.535 5，連續斷裂3 個鼠李糖，分別得到離子碎片m／z867.482 4、721.417 9、575.358 8，失去一分子的葡萄糖得到離子碎片m／z413.228 8，結合化合物結構、碎片離子、對照品比對，推測峰22 為重樓皂苷Ⅱ，質譜圖見圖3。峰24 分子離子m／z853.464 5 失去一分子阿拉伯糖得到碎片離子m／z721.418 7，失去一分子鼠李糖得到m／z575.361 9 碎片離子，失去一分子葡萄糖，生成母核結構離子碎片m／z413.082 9。

圖3 峰22 一級（A）、二級（B） 質譜圖

3.1.2 呋甾烷醇型和C21 甾體 呋甾烷醇型為F 環開環的甾體皂苷，一般在C3-OH、C26-OH 位與葡萄糖成苷。根據化合物結構、裂解碎片信息、文獻數據等，推測峰8 和峰12 為呋甾烷醇型皂苷。峰8 分子離子為m／z1 049.525 4，失去兩分子鼠李糖和兩分子葡萄糖（C3、C26位） 得到母核結構碎片為m／z433.161 7，推測其為重樓皂苷G。峰12 甲酸根加合離子為m／z1 109.547 4，失去一分子鼠李糖得到碎片m／z917.483 0，失去一分子鼠李糖得到m／z755.431 0，失去C3位的葡萄糖產生碎片m／z593.373 0，失去C26位葡萄糖生成碎片m／z431.320 6，根據化合物結構、質譜裂解規律，推斷峰12 為重樓皂苷H。C21甾體皂苷為重樓皂苷活性成分，峰4 分子離子為m／z977.430 7，失去一分子鼠李糖生成碎片m／z845.384 3，失去一分子半乳糖生成碎片m／z665.321 2，斷裂一分子鼠李糖得到m／z519.260 3，推測峰4 為parisyunnanoside J。

3.1.3 其他 負離子模式下，峰21 分子離子m／z313.240 4 脫去一分子羰基生成碎片離子m／z285.228 4，根據質譜裂解碎片、文獻數據對比，可推測為myrincitrin。峰26 分子離子失去一分子鼠李糖和一分子葡萄糖，生成黃酮母核結構碎片離子m／z287.235 4，可推測為7-O-rhakaempferol-3-O-glc。峰1 分子離子m／z479.306 1 脫去一分子水生成碎片離子m／z461.292 1，失去C7H14O4支鏈結構得到碎片m／z319.195 5，失去一分子C7H14O4和兩分子水生成m／z283.170 6，可推測為β-ecdysone。峰17 分子離子脫去一分子葡萄糖生成母核結構m／z348.278 4。

3.2 網絡藥理學分析

3.2.1 重樓治療肺癌的關鍵靶點分析 根據滇重樓化學成分表征，結合相關文獻，查詢滇重樓中化學成分Canonical SMILES 字符串。得到16 種活性成分，均具有抗肺癌作用，其中 UPLC-Q-TOF-MS／MS 法鑒定得到9 種成分 （βecdysone、重樓皂苷B、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷G、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅲ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅴ），文獻查找得到7 種成分（dioscinin、chonglouoside SL-13、chonglousideSL-15、parisyunnanosideA、parisyunnanoside B、parisyunnanoside F、重樓皂苷F）。采用Swiss Target Prediction 平臺對16 種活性成分進行靶基因預測，共得到455 個相關靶點，進一步剔除重復靶點后得到靶點344 個。運用GeneCards 數據庫篩選與肺癌相關的靶點，共23 470 個。剔除重復的并選擇相關性得分大于20 的肺癌相關靶點798 個。將重樓344 個活性成分靶點與798 個肺癌疾病靶點繪制韋恩圖（圖4），獲得滇重樓抗肺癌共性靶點91 個。

圖4 滇重樓提取物成分與肺癌靶點韋恩圖

3.2.2 活性成分-靶點網絡分析 將滇重樓中抑制肺癌作用的16 種活性成分和344 個交集靶點導入Cytoscape 軟件，構建成分靶點網絡圖，見圖5。結果顯示，共有92 個節點，16 個六邊形節點為重樓提取物的16 種活性成分，76 個圓形節點代表與成分對應的潛在相關靶點。采用“NetworkAnalysizer” 分析網絡圖，得到化合物靶點相關度大小，得到重樓皂苷 VI、重樓皂苷 V、dioscinin、parisyunnanoside F、重樓皂苷I 為相關度較大的成分。

圖5 成分-潛在相關靶點網絡圖

3.2.3 重樓治療肺癌的關鍵靶點PPI 網絡 將滇重樓抗肺癌靶點基因導入STRING 數據庫，查詢靶點的相互作用關系，進行可視化分析得到疾病蛋白相互作用網絡圖，見圖6。將Combined score＞0.9 為篩選條件，共得到69 個關鍵的治療肺癌靶點。將這69 個靶點與對應的成分進行匹配，按照度值大小進行排序，得到β-ecdysone、dioscinin、重樓皂苷B、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅴ為貢獻較高成分。綜合活性成分-靶點分析結果，得到dioscinin、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅴ為滇重樓治療肺癌的關鍵成分。

圖6 重樓治療肺癌潛在靶點的PPI 網絡圖

3.2.4 重樓治療肺癌的KEGG、GO 分析 GO 富集分析分為生物過程、細胞組成、分子功能。利用WebGestalt 對69個關鍵靶點基因進行GO 生物功能標注，分別對前10 個條目進行可視化分析，見圖7A。結果表明，生物過程主要涉及酪氨酸多肽磷酸化、酪氨酸多肽修飾、阿米巴型細胞遷移、組織遷移、跨突觸信號調節等。細胞組成主要影響膜筏、膜微區、遠端軸突、質膜筏。分子功能主要包括蛋白絲氨酸／蘇氨酸激酶活性、蛋白絲氨酸激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等方面。

圖7 重樓活性成分GO 生物過程分析（A） 和活性成分-靶點KEGG 通路富集分析（B）

利用WebGestalt 數據庫對關鍵靶點基因進行KEGG 富集分析。由圖7B 可知，關鍵靶點主要富集通路為PI3K-Akt信號通路、Ras 信號通路、MAPK 信號通路、鈣離子信號通路、Rap1 信號通路、蛋白聚糖等。

4 討論

滇重樓提取液化學共鑒定出活性成分26 種，多數為異螺甾烷醇型皂苷，包含薯蕷皂苷型和偏諾皂苷型。研究發現，薯蕷皂苷型重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅴ，偏諾皂苷型重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ，均具有良好的抗腫瘤活性［10-13］，為滇重樓提取液抗腫瘤提供理論支持。中藥發揮藥效為多成分、多靶點協同作用的結果。中藥提取液中包含大量活性成分，那些成分可以發揮協同增效作用。有必要對中藥中活性成分，進行整體藥效關聯分析，尋找具有協同增效的功效成分。

本研究在全面表征滇重樓活性成分的基礎上，對活性成分靶點及肺癌相關靶點進行預測，取兩者交集進行后續成分-靶點關聯分析。篩選出了與功效相關的關鍵靶點，與靶點相關度較大的成分有dioscinin、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅴ。研究發現，dioscinin 可抑制腫瘤細胞HeLa、L929、MCF 的增殖，從而發揮良好抗肺癌的作用［14］。重樓皂苷Ⅵ可抑制腫瘤細胞LA795，重樓皂苷Ⅴ可抑制腫瘤細胞HeLa、L929，有效抑制肺癌細胞的增長［15］。結果表明，通過活性成分結合網絡藥理學方法，可有效篩選具有抗肺癌作用的活性成分，這些成分在調控疾病相關靶點發揮了協同增效的作用。

滇重樓活性成分發揮抗肺癌作用，主要富集通路為PI3K-Akt 信號通路、Ras 信號通路、MAPK 信號通路等。PI3K-Akt 信號通路通過刺激活化PI3K，催化產生磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，下游靶點Akt 轉運至細胞膜上，進一步被磷酸化獲得活性，從而發揮調控下游細胞功能。研究表明重樓皂苷Ⅱ能增加PI3K、Akt 磷酸化及mRNA 表達，從而抑制PI3K-Akt 信號通路來抑制重樓肺癌細胞生長［14］。重樓皂苷Ⅶ能夠促進AMPK 和Bcl-2 磷酸化，抑制PI3K／Akt／mTOR 磷酸化，從而誘導肝癌細胞HepG2 凋亡［16］。MAPK 信號通路通過上游生長因子與特定受體結合，逐級產生磷酸化反應，促進細胞凋亡。Zhang 等［17］研究發現，重樓皂苷Ⅶ能夠增加JNK、ERK、p38 磷酸化水平，通過MAPK 信號通路，抑制腫瘤蛋白p53、PTEN 表達。此外，重樓皂苷Ⅶ通過MAPK 信號通路，抑制炎癥細胞因子TNFα、IL-1β、IL-6、一氧化氮合酶、環氧合酶-2 等水平，從而抑制LPS 誘導的RAW264.7 炎性細胞［18］。在Ras 信號通路中，Raf1 作為為主要效應因子并發揮作用，研究證明其通過抑制腫瘤組織中Ras／Raf1 的表達，可有效抑制IL-6 等炎癥介質水平。研究表明，重樓皂苷提取物及其單體成分能夠有效抑制肺癌細胞的生長。然而，對于Ras 信號通路的相關研究報道較少。

5 結論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 技術結合網絡藥理學明確了重樓抗肺癌的關鍵活性成分是dioscinin、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅴ。滇重樓活性成分發揮抗肺癌作用主要通過PI3KAkt 信號、Ras 信號、MAPK 信號等通路。通過篩選滇重樓抗肺癌作用的藥效物質基礎、潛在作用靶點及通路，為滇重樓抗肺癌新藥的研發提供理論依據。