食品中霉菌和酵母計(jì)數(shù)的不確定度評定

魏 敏，姜華軍，王言爽，程 丞

（威海市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，山東威海 264210）

霉菌和酵母菌都屬于真菌類，在自然界中廣泛分布。當(dāng)食品受到霉菌和酵母菌污染時(shí)，易發(fā)生霉壞變質(zhì)。很多種類的霉菌能夠產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物，從而引起急性或慢性中毒，特別是黃曲霉毒素等真菌毒素具有很強(qiáng)的致癌性[1]。在食品微生物學(xué)中，霉菌和酵母計(jì)數(shù)是重要的指示菌指標(biāo)，可用于評價(jià)食品的被污染程度，在乳制品、飲料、糕點(diǎn)等多個(gè)產(chǎn)品類別的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中都制定有霉菌或霉菌和酵母菌總數(shù)的限量要求[2-5]。為進(jìn)一步加強(qiáng)本實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量管理，評價(jià)本實(shí)驗(yàn)室的檢測能力，本實(shí)驗(yàn)室參加了面粉中霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證，并進(jìn)行測量不確定度的評定，以進(jìn)一步提高霉菌和酵母計(jì)數(shù)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，北京路橋技術(shù)股份有限公司；面粉中霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)能力驗(yàn)證樣品，中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

電 子 天 平（XPR1202S）， 瑞 士METTLER TOLEDO 公司；拍擊式均質(zhì)器（Bagmixer 400SW），法國Interscience 公司；霉菌培養(yǎng)箱（MI-250A），美國STIK 公司；生物安全柜（AB2-4S1），新加坡ESCO 公司；立式壓力蒸汽滅菌器（HVE-50），日本Hirayama 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）第一法霉菌和酵母平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行能力驗(yàn)證樣品的檢測[6]。

量取225 mL 無菌生理鹽水置于均質(zhì)袋中，在生物安全柜內(nèi)打開能力驗(yàn)證樣品的西林瓶，將樣品加入均質(zhì)袋，同時(shí)加入25 g 對應(yīng)的面粉基質(zhì)，拍擊均質(zhì)1 min，得到1 ∶10 樣品勻液。吸取1 mL 1 ∶10樣品勻液，注于9 mL 無菌生理鹽水中，混勻制成1 ∶100 樣品勻液。按上述步驟，依次進(jìn)行10 倍系列稀釋。選擇2 個(gè)適宜稀釋度，從每個(gè)稀釋度的樣品勻液中分別吸取1 mL 加入2 個(gè)無菌培養(yǎng)皿，空白對照為吸取1 mL 無菌生理鹽水加入2 個(gè)無菌培養(yǎng)皿。將融化的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基冷卻至46 ℃，立即傾注約25 mL 于每個(gè)培養(yǎng)皿中，混合均勻。瓊脂凝固后將平板正置，放入28 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察并報(bào)告檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立數(shù)學(xué)模型

待測樣品中霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)算公式為

則樣品制備引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

式中：T為待測樣品中霉菌和酵母菌總數(shù)，CFU·g-1；C為某一稀釋度的1 個(gè)平板中霉菌和酵母的菌落數(shù)之和，CFU；V為樣品勻液加樣體積，mL；d為稀釋因子，g·mL-1。

2.2 不確定度分量的來源分析

霉菌和酵母計(jì)數(shù)的不確定度來源主要有樣品制備urel(P)、樣品稀釋urel(D)、加樣過程urel(S)和重復(fù)性測量urel(R)。

2.3 不確定度分量的評定

2.3.1 樣品制備引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(P)

本實(shí)驗(yàn)稱取25.00 g 能力驗(yàn)證面粉樣品，加入到225 mL 無菌生理鹽水中，不確定度主要來源于稱量面粉樣品時(shí)電子天平引入的不確定度和量取無菌生理鹽水稀釋液時(shí)量筒引入的不確定度。

所用電子天平感量為0.01 g，根據(jù)《電子天平檢定規(guī)程》（JJG 1036—2008）[7]，其最大允許誤差為±0.05 g，按均勻分布，

2.3.2 樣品稀釋引入的不確定度urel(D)

本實(shí)驗(yàn)依次吸取1 mL 不同稀釋度的樣品勻液加入9 mL 無菌生理鹽水中進(jìn)行10 倍系列稀釋，吸取樣品勻液和生理鹽水分別用到1 mL 和10 mL 吸量管，因此不確定度主要來源于移取液體時(shí)吸量管引入的不確定度。根據(jù)JJG 196—2006[8]，1 mL 和10 mL 吸量管的容量允差分別為±0.008 mL 和±0.05 mL，按均勻分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

則樣品稀釋時(shí)1 mL 和10 mL 吸量管引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

每稀釋一次需分別使用一次1 mL 和10 mL 吸量管，本實(shí)驗(yàn)采用1 ∶100 稀釋度的平板進(jìn)行霉菌和酵母計(jì)數(shù)，即只進(jìn)行了一次稀釋。樣品稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，則稱量樣品時(shí)電子天平引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

稱量樣品時(shí)電子天平引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.3 加樣過程引入的不確定度urel(S)

本實(shí)驗(yàn)加樣過程是用1 mL 吸量管分別吸取1 mL 樣品勻液加入2 個(gè)培養(yǎng)皿中，1 mL 吸量管引入的不確定度計(jì)算方法同2.3.2。加樣過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

所用量筒容量為250 mL，根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[8]，其容量允差為±2.0 mL，按均勻分布，，則量取稀釋液時(shí)量筒引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

量取稀釋液時(shí)量筒引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3.4 重復(fù)性測量引入的不確定度urel(R)

在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，由同一名檢驗(yàn)人員對能力驗(yàn)證樣品中的霉菌和酵母總數(shù)重復(fù)檢測20 次，20 次檢測結(jié)果的平均值以X—表示，結(jié)果見表1。由于檢測結(jié)果有很大的發(fā)散性，若直接計(jì)算樣本標(biāo)準(zhǔn)差，所得到的不確定度很大。本研究將重復(fù)檢測的結(jié)果均轉(zhuǎn)換為以10 為底的對數(shù)值后再進(jìn)行不確定度的計(jì)算[9-11]。

表1 能力驗(yàn)證樣品中霉菌和酵母計(jì)數(shù)重復(fù)檢測結(jié)果

用貝塞爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，得到樣品重復(fù)性測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4 相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)以上各不確定分量的評定結(jié)果進(jìn)行不確定度的合成，霉菌和酵母計(jì)數(shù)的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

[6] 國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù):GB 4789.15—2016[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016.

[7] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.電子天平檢定規(guī)+0程 規(guī)u5r2 程e:6 l J(3JDG:2

[ J8+)J] 1G+00國.3u1069r2家e0—l66(— 質(zhì)S25)023量+002 80u+監(jiān)[6r2Se0[l S] 督(.. 0R] 北.1檢)北2京 驗(yàn)7京0:檢2 中:=中疫0國.國0總質(zhì)1計(jì)6局檢 量2出.3常 出版版用社社玻,2璃,02 00量80.6器.檢定

[9] 趙玲,王邱,王冰,等.飲料中霉菌和酵母計(jì)數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果的不確定度評估[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào),2016,7(12):4749-4752.

2.5 擴(kuò)展不確定度

根據(jù)JJF 1059.1—2012[12]，取置信概率p=95%，自由度ν=19，查詢t分布表得到包含因子k=2.09，擴(kuò)展不確定度為

2.6 結(jié)果報(bào)告

樣品中霉菌和酵母計(jì)數(shù)檢測結(jié)果的對數(shù)值為lgX=3.668 4±0.033 9，取反對數(shù)之后得到霉菌和酵母計(jì)數(shù)檢測結(jié)果為4 310 ～5 038 CFU·g-1，修約后為4 300 ～5 000 CFU·g-1。

3 結(jié)論

本研究按照GB 4789.15—2016 進(jìn)行面粉中霉菌和酵母計(jì)數(shù)能力驗(yàn)證樣品的檢測，并對測量不確定度進(jìn)行評定。不確定度主要來源于樣品制備、樣品稀釋、加樣過程和重復(fù)性測量。從評定結(jié)果來看，對霉菌和酵母計(jì)數(shù)不確定度貢獻(xiàn)最大的是樣品重復(fù)性測量引入的不確定度。重復(fù)性測量引入的不確定度屬于A 類不確定度，受檢測人員、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、樣品均勻性等因素的影響。實(shí)驗(yàn)室可從多方面加強(qiáng)質(zhì)量控制，降低不確定度，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。