汛期前后不同土地利用類型河流浮游細菌組成及功能預測：以清潩河(許昌段)為例

王革林，谷立坤，于魯冀，劉萌碩，魯浩天，范鵬宇，王 莉*

1.鄭州大學生態與環境學院，河南 鄭州 450000

2.河南工程學院，河南 鄭州 450000

3.鄭州大學綜合設計研究院有限公司，河南 鄭州 450000

浮游細菌是水生態系統的主要組成部分，具有種類豐富、功能多樣和環境響應靈敏等特點[1-2]，可通過同化、異化等代謝過程影響生態系統中的物質循環、污染物質釋放等地球化學循環過程[3-5]，是提高河流水環境自凈能力和河流生態系統修復能力的關鍵因素[6].浮游細菌空間格局的形成，受空間異質性和河流連通度的影響，河流生態系統水位的變化(包括汛期)改變了河流連通度，進而造成浮游細菌多樣性和功能的差異[7-9].汛期時，強降雨將外源污染物帶入河流，引起水體營養鹽的變化，影響浮游細菌群落的組成[10].細菌的隨流輸運能力受河流連通度的影響，水位較高時，河道連通度增大，進而影響細菌群落空間構成.此外，人類活動和土地利用方式的改變也是影響浮游細菌空間差異的主要原因[11].土地利用類型的變化直接反映了人類活動對河流水質和水生態的重要影響力[12].不同利用類型的土地以各自的方式影響著地表水的傳輸(阻滯或加速)，進而影響污染物從陸地到地表水的傳遞[13].改變后的地表水將形成一種與原始環境不同的河流生境，產生基于水生生物對新形成環境適應性的生物篩選，構成不同的浮游細菌群落結構.

為了適應不同類型的棲息地，微生物經常會形成一些特定的結構和功能去應對不同的環境壓力[14].已有研究表明，降雨徑流污染是城市景觀水體氮磷等營養鹽的主要來源之一[15]，降雨會將土壤中積累的營養鹽帶入水體，也會引起水體水文和水動力學特征的變化，造成浮游細菌群落變化[16].鄉村區和城鎮區人類活動強度和土地利用方式的差異也是造成河流細菌空間異質性的主要原因[11]，在重金屬含量較高的城鎮區和農業區河段，微生物多樣性較低，在陸源污染輸入較少的居民區和清潔區，微生物多樣性差異性較小[17]，β-變形菌和δ-變形菌在清潔區豐度顯著高于工業區和農業區[18]，α-變形菌和γ-變形菌的豐度在工業區和居民區最高.因此，了解汛期前后不同土地利用類型浮游細菌群落組成變化和功能差異，對于識別水域浮游細菌在生態系統中的功能和作用，治理和保護水生態環境具有深遠的意義.

本研究以清潩河流域為研究對象，依據周邊環境及水生態環境功能分區將流域劃分為不同土地利用類型的河段，采用高通量測序技術分析了汛期前后不同土地利用類型河段內浮游細菌群落結構，并基于PICRUSt2 進行了浮游細菌功能基因預測，尤其是氮循環功能基因.結合水環境理化指標，進一步探討了引起浮游細菌群落組成和功能變化的環境因子，以期為不同土地利用類型河流水環境保護提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 采樣點分布及樣本采集

本研究以河南省清潩河流域為對象，依據趙雪霞等[19]在清潩河流域(許昌段)的水生態環境功能分區體系，綜合考慮自然地理因素(地貌、河流自然狀況)和人為因素(水資源利用狀況、水環境污染狀況和土地資源利用狀況)，將研究區域劃分為4 個不同土地利用類型的河段，分別為清潔區(clear water area，CW)、城鎮區(urban area，UW)、鄉村區(village area，VW)和農業區(agricutural area，AW)，如圖1 所示.在清潩河流域共選取32 個采樣點，其中C1～C4位于清潩河干流上游，C1點位為增福廟水庫，C2～C4為水庫下游，兩側人類干擾較少，劃分為清潔區；U1～U14流經長葛市，人口密度大，有工業企業存在，劃分為城鎮區；V1～V6位于清潩河二級支流灞陵河，流經多為村莊，河岸兩側有生活污水排放口存在，劃分為鄉村區；A1～A8位于清潩河一級支流小泥河，兩岸多為農田，無排污口影響，劃分為農業區.

圖1 研究區采樣點的分布Fig.1 Distribution of sampling points in the study area

每年7-9 月為清潩河汛期，本研究樣品采集工作于汛期前(2021 年6 月) 和汛期后(2021 年10 月)進行.大部分采樣點河段水深不超過4 m，使用有機玻璃采水器采集水面下0.5～1.0 m 處水樣于玻璃采樣瓶內，帶回實驗室儲存于4 ℃冰箱內，并在48 h 內完成理化指標的檢測.量取600 mL 水樣經20 μm 篩絹預過濾，除去大型浮游植物和浮游動物，預過濾后的水樣經0.22 μm 無菌微孔濾膜過濾，用以收集浮游細菌，將濾膜剪碎置于50 mL 無菌離心管中.在干冰保存狀態下送往廣州美格基因科技有限公司進行微生物檢測.

1.2 理化指標檢測方法

將采集的水樣在實驗室過濾后，依據《水和廢水監測分析方法》測定其理化性質.溶解氧(DO)濃度和水溫(WT) 采用便攜式水質監測儀(HACH-DS5，哈希，美國)測定；pH 和氧化還原電位(ORP) 采用pH 計(HI-8424，哈納，意大利) 測定；電導率(EC)采用便攜式電導率儀(S7-Meter，梅特勒托利多，美國)測定；總氮(TN)濃度采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定；總磷(TP)濃度采用過硫酸鉀消解鉬銻鈧比色法測定；氨氮(NH4+-N)濃度采用納氏試劑分光光度法測定；亞硝態氮(NO2--N)濃度采用N-乙二胺分光光度法測定；硝態氮(NO3--N)濃度采用酚二磺酸法測定；化學需氧量(CODCr)采用重鉻酸鉀法測定.

1.3 高通量測序分析

使用DNA 提取試劑盒對濾膜進行基因組DNA抽提后，采用微量紫外分光光度計(NanoDop?ND-1000，Wilmington，DE，美國)測定提取到的DNA 濃度和純度.將合格的樣品送往廣州美格基因科技有限公司，通過MiSeq 300(Illumina Inc，San Diego，CA，美國)測序儀完成高通量測序，結果以FASTQ 文件格式儲存.使用fastq 軟件對原始數據進行質控，而后使用FLASH 軟件進行拼接[18].使用Qiime2 流程在基于默認參數上對質控拼接之后的序列降噪處理[19].按最小樣本序列進行抽平，再參照Sliva 16S rRNA 數據庫(v 138)，使用Qiime2 中的Naive bayes 對ASVs 進行物種分類分析.

1.4 數據統計分析

理化指標分析：由于各組樣品理化指標數據無法同時滿足正態分布和方差齊性，故使用 Schirer-Ray-Hare非參檢驗法進行水質數據分析[20]，單因素或多因素ANOVA 用于探討樣點間環境因子和浮游細菌多樣性的差異.

生物指標分析：通過R 軟件的“vegan”包計算浮游細菌群落結構的α多樣性，分別以Chao 指數和Shannon-Wiener 指數表示細菌的豐度和多樣性.在美格基因云平臺(http://cloud.magigene.com) 進行物種組成分析和β多樣性分析并繪圖.使用LefSe 在線工具分析各組之間顯著性差異的生物標志物，進一步分析各組細菌豐富度差異[21].使用SPSS 軟件對細菌和環境因子做Spearman 相關性分析，所得結果在Origin內以熱圖的形式呈現.使用PICRUSt2 軟件將16S rRNA序列與參考基因組數據庫進行比對，預測細菌代謝功能，并結合16S rRNA 基因拷貝數差異和原始ASV 表格的物種豐度數據進行校正，提高豐度預測可靠性[22].

2 結果與分析

2.1 河流水質理化性質

汛期前后清潩河理化指標Schirer-Ray-Hare 檢驗結果如表1 所示.研究發現，汛期前，河流TN 濃度整體的平均值為(7.57±2.40) mg/L，超GB 3838-2002《地表水環境質量標準》Ⅲ類標準限值5.0～10.0 倍；VW 區NH4+-N 濃度最高(3.19 mg/L)，達到劣Ⅴ類標準.汛期后，UW、VW 和AW 區TN 濃度幾乎不發生變化，NH4+-N 濃度達到Ⅴ類標準；NO3--N 和NO2--N濃度大于汛期前，且NO3--N 在人類干擾較大的UW、VW 和AW 區增加量高于CW 區.

表1 不同時期清潩河流域水體理化指標Table 1 Physical and chemical indexes of Qingyihe River Basin at different periods

2.2 浮游細菌多樣性和豐度分布特征

汛期前后各區域河段Chao 指數和Shannon-Wiener指數的變化情況如圖2 所示.汛期前，受人類干擾較強的AW、UW 和VW 區Chao 指數及Shannon-Wiener指數均顯著(P＜0.05)高于CW 區.汛期后，Chao 指數和Shannon-Wiener 指數均表現出AW 區＞VW 區＞CW區＞UW 區的特征，與汛期前相比，Chao 指數和Shannon-Wiener 指數均有所下降，其中UW 區下降最多，CW 區下降最少.

圖2 不同區域多樣性指數分析Fig.2 Diversity index analysis chart

在ASV 水平上對汛期前后各區域采樣點位的浮游細菌進行PCoA 分析，結果(見圖3) 顯示，PCoA1軸解釋度為29.9%，PCoA2 軸解釋度為15.4%.沿PCoA1 軸方向CW 區與其他三區有明顯區分，且汛期前后UW、VW 和AW 區的差別明顯.沿PCoA2 軸方向CW 區汛期前和汛期后區分明顯，汛期前，VW和UW 區顯著區分，與AW 區重疊；汛期后，VW、UW 和AW 區重疊，說明汛期對有人類干擾的UW、VW 和AW 區浮游細菌群落差異作用大于土地利用類型的影響.

2.3 浮游細菌群落組成與差異

2.3.1 群落組成特征

2.3.1.1 優勢菌組成特征

高通量測序結果〔見圖4(a)〕表明，汛期前后四區域浮游細菌主要有變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)等12 個菌門組成，占總菌門的98%以上.變形菌門是UW、VW 和AW 區的第1 優勢菌門，相對豐度在51.8%～54.7%之間，遠高于CW 區的35.5%.放線菌門是CW 區的第1 優勢菌門，相對豐度為46.9%，其他三區放線菌門的相對豐度僅在16.1%～22.9%之間；擬桿菌門是UW 區的第2 優勢菌門，是其他三區的第3 優勢菌門；UW 區綠彎菌門和酸桿菌門的相對豐度均高于其他三區.汛期后浮霉菌門(Planctomycetes)相對豐度有所增加，而裝甲菌門(Armatimonadetes)的相對豐度下降，硝化螺菌門(Acidobacteria)的相對豐度在各區表現為UW 區＞VW區＞AW 區＞CW 區.

圖4 不同區域河流浮游細菌群落組成Fig.4 Composition of river bacterioplankton community in different regions

對汛期前后各區域豐度排名前28 位的優勢菌屬進行分析，結果如圖4(b)所示.優勢菌屬主要為hgcI_clade、Limnohabitans、Acinetobacter、CL500-29_marine_group、Flavobacterium等，在各區域中占總菌群豐度的52.2%～81.5%.相對于UW、VW 和AW 區，CW 區表現出較高的hgcI_clade和CL500-29_marine_group相對豐度，且汛期后大于汛期前；而UW、VW 和AW 區Limnohabitans和Acinetobacter 的相對豐度大于CW 區，且汛期后Limnohabitans在UW 區增加最多.汛期后Acidibacter、Flavobacterium和Nitrospira的相對豐度大于汛期前.

2.3.1.2 致病菌分布特征

根據世界衛生組織《飲用水質量準則》(第四版)[23]中飲用水中致病微生物列表，篩選出對人類具有致病作用的優勢菌群進行分析，結果如圖5 所示.汛期前，河流主要致病菌屬為Acinetobacter、Flavobacterium和Pseudomonas，在CW 和UW 區的相對豐度約是VW 和AW 區的5 倍，且Acinetobacter的相對豐度占CW 和UW 區總致病菌屬的86%以上，Flavobacterium的相對豐度占VW 和AW 區總致病菌屬的33%～60%.汛期后，CW 和UW 區致病菌屬的相對豐度下降明顯，VW 和AW 區致病菌屬的相對豐度略有增加；河流主要致病菌屬為Flavobacterium和Acinetobacter，且Flavobacterium的相對豐度占UW和VW 區總致病菌屬的80% 以上，Acinetobacter的相對豐度占AW 區總致病菌屬的64.1%.

圖5 汛期前后不同區域河流致病菌屬相對豐度Fig.5 Relative abundance of fluvial pathogens in different regions before and after flood season

2.3.2 群落差異分析

通過LEfSe 工具計算汛期前后各區域中的差異菌屬，所有菌在門綱目科屬水平的差異信息用餅形圖表示[24-25].如圖6 所示，汛期前后浮游細菌群落共有18 個菌門存在顯著差異，優勢菌門(LDA≥4.0)僅有放線菌門、Patescibacteria、變形菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、藍藻門和疣微菌門等8 個菌門.汛期前優勢菌門中，AW 區的擬桿菌門、CW 區的放線菌門、VW 區的疣微菌門和藍藻門與其他區域存在顯著性差異；汛期后優勢菌門中，僅有UW 區的酸桿菌門、CW 區的浮霉菌門和疣微菌門與其他區域有顯著性差異(P＜0.05).

圖6 不同樣品間差異的季節分布Fig.6 Different seasonal distribution among different samples

在屬水平上，汛期前，CW 區有10 個菌屬與其他區域存在顯著性差異(P＜0.05)，其中α-變形菌的Sphingorhabdus、Sphingomonas和Hyphomonas，厚壁菌門的Chryseomicrobium和Exiguobacterium，擬桿菌門的Sphingobacterium和Candidatus_Aquirestis為優勢屬(LDA≥4.0)；UW 區有17 個屬存在顯著性差異，其中α-變形菌的Rhodobacter和Magnetospirillum，δ-變形菌的Oligoflexus，γ-變形菌的Azospira、Acinetobacter和Pseudomonas，酸桿菌門的Pseudarthrobacter，嗜熱絲菌門的Caldisericum，疣微菌門的Terrimicrobium和Luteolibacter為優勢菌屬；VW 區共有16 個屬存在顯著性差異，其中α-變形菌的Novosphingobium，γ-變形菌的GKS98_freshwater_group和Sphaerotilus，藍藻菌門的Cyanobium_PCC_6307，疣微菌門的Brevifollis為優勢菌屬；AW 區有11 個屬于存在顯著性差異，其中擬桿菌門的Cloacibacterium，變形菌門的Polynucleobacter和C39為優勢菌屬.汛期后具有差異性的菌屬減少，其中CW 區有10 個菌屬存在顯著性差異，酸桿菌門的CL500_29_marine_group和hgcI_clade，浮霉菌門的CL500_3，γ-變形菌的Limnobacter，疣微菌門的LD29為優勢菌屬；UW 區有12 個屬存在顯著性差異，酸桿菌門的Aurantimicrobium，擬桿菌門的Pseudarcicella、Flavobacterium和Solitalea為優勢菌屬；VW 區有7 個菌屬存在顯著性差異，僅擬桿菌門的Sediminibacterium為優勢菌屬；AW 區有11個屬存在顯著性差異，放線菌門的Candidatus_Planktoluna，變形菌門的Limnohabitans和Malikia為優勢菌屬.

2.3.3 微生物群落組成與環境因子的關系

通過Mentel Test 分析，發現汛期前各區域浮游細菌優勢屬與環境因子存在極顯著相關關系(P=0.008)，將水體理化參數與優勢菌屬進行RDA 排序，結果如圖7(a)所示，各區域點位區分明顯，主要受pH、DO濃度、COD 濃度、NH4+-N 濃度和EC 的影響.AW 區樣品差異較小，主要受COD 濃度、NH4+-N 濃度和EC 因素的影響；UW、VW 和CW 區樣品差異性較大，引起群落差異的主要環境指標為pH、DO 濃度和NO3--N 濃度.RDA 分析結果也表明，Sediminibacterium、Candidatus_Aquiluna和Fluviicola均與COD和NH4+-N濃度呈正相關.

圖7 不同區域浮游細菌與環境因子RDA 分析Fig.7 RDA analysis of bacterioplankton and environmental factors in different regions

汛期后，Mentel Test 分析也表明環境因子與浮游細菌優勢屬呈顯著相關(P=0.012)，將結果進行RDA排序后，如圖7(b) 所示.汛期后樣品間差異性更小，主要影響因子為pH、NO3--N 濃度、NO2--N 濃度、TN濃度和ORP.CW 區樣品差異主要受ORP、TP 濃度和NH4+-N 濃度的影響；AW 區樣品差異主要受pH、DO 濃度、ORP 和TP 濃度的影響；UW 和VW 區樣品差異主要受COD、NO3--N、NO2--N、TN 濃度及ORP的影響.排序結果也表明，Limnohabitans、hgcI_clade、Acidibacter和CL500-29_marine_group與TP、NH4+-N、COD 濃度及ORP 均呈顯著負相關；MWH-UniP1_aquatic_group和Acinetobacter與pH 和DO 濃度均呈正相關.

為進一步明確浮游細菌與環境因子之間的關系，將優勢菌門和優勢菌屬與環境因子做Spearman 相關性分析.由圖8(a)可知，影響微生物菌門的主要環境因子有化學指標COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN和TP，以及物理指標ORP 和EC，且這些指標與擬桿菌門和Epsilonbacteraeota 門均呈顯著正相關，與藍菌門、芽單胞菌門、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、衣原體門、酸桿菌門、浮霉菌門、疣微菌門、Patescibacteria、綠彎菌門、放線菌門和 Dependentiae門均呈顯著負相關.

圖8 細菌群落結構與環境因子Spearman 相關性熱圖Fig.8 Bacterial community structure and environmental factor Spearman correlation heat map

優勢菌屬多為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和藍藻菌門.由圖8(b)可知，變形菌門的Pseudorhodobacter、Limnohabitans和Limnobacter屬均與COD、NH4+-N、NO2--N 和NO3--N 濃度呈顯著相關；擬桿菌門的Sediminibacterium、Solitalea、Flavobacterium和Fluviicola均與NO2--N、NO3--N、TN 和COD 濃度呈顯著正相關；藍菌門的Cyanobium_PCC-6307與NO2--N、NO3--N 和TP 濃度均呈顯著負相關.

2.4 微生物群落氮轉化功能分析

為了解汛期前后不同土地利用類型河流浮游細菌功能的差異，采用PICRUSt2 軟件將樣本的ASV序列與內部參與序列進行對比，預測每個ASV 的基因拷貝數，確定樣本的基因豐度，結果如圖9 所示.通過數據庫比對，在一級水平上獲得樣本的6 大功能信息[26-27]，發現新陳代謝是清潩河流域的主要功能，占比為81.4%～82.2%，在UW 區占比最大，AW 區占比最小，汛期前后占比不變.在二級水平上主要由29 個子功能組成，其中細胞活性、脂質代謝、碳水化合物代謝等9 個功能在CW 區占比為68.4%，遠高于其他三區；汛期后，癌癥概要、其他氨基酸代謝、聚糖生物合成與代謝等8 個功能在UW 區占比最高，其他次生產物的生物合成、翻譯、膜運輸等9 個功能在AW區占比最高.

進一步將樣本基因序列和KEGG 數據庫中65個氮代謝相關的基因進行比對，篩選出參與氮代謝過程豐度最高的基因[28]，發現反硝化、氮同化和異化還原過程相關基因豐度較高，固氮和硝化過程相關基因豐度較低.由圖10 可知，編碼固氮酶的nifK、nifH和nifK基因在汛期后VW 區和汛期前AW 區占比均較高；編碼氨單加氧酶的amoA、amoB、amoC和編碼羥胺氧化還原酶的hao基因在CW 區和汛期前AW 區豐度均較高.反硝化過程中，編碼硝酸鹽還原酶的narG和narH基因在AW 區豐度均較高，且汛期后大 于汛期前；編碼亞硝酸還原酶的nirK基因在汛期前VW 和AW 區豐度均較高；編碼一氧化氮還原酶的norB、norC基因，以及編碼氧化亞氮還原酶的nosZ基因在VW 和AW 區豐度均較高.硝酸鹽異化還原過程中，編碼硝酸鹽異化還原酶的napA和napB基因與編碼固氮酶的基因豐度分布相同；編碼甲酸依賴型亞硝酸鹽還原酶的nrfA基因豐度汛期后高于汛期前，且在汛期后UW 和VW 區豐度較高；編碼亞硝酸鹽還原酶的nirD基因豐度最高.硝酸鹽同化還原過程中，編碼硝酸鹽同化還原的nasA和nirB基因豐度均高于narB、nasB和nirA基因.

圖10 氮代謝功能基因熱圖Fig.10 Heat map of functional genes of nitrogen metabolism

3 討論

3.1 汛期前后不同土地利用類型河流浮游細菌多樣性變化特征

汛期前浮游細菌多樣性高于汛期后.汛期前，流速較慢，穩定的水體為浮游細菌提供了良好的環境，有利于處于競爭弱勢的細菌繁殖，提高了細菌多樣性[29]；河流水溫偏高，水體中細菌活性較強，進而導致浮游細菌在不同環境中表現出較大的空間差異性[30].汛期時，徑流量增大，水位升高，河道連通性加強，促進了細菌的擴散和稀釋作用，使得細菌空間差異性變小[31]；強降雨將土壤中積累的營養鹽帶入河流，使NH4+-N 和NO3--N 濃度增加，導致降解污染物的特異性菌群大量繁殖抑制其他細菌的生長[4]，造成多樣性下降，這種效應在汛期后仍然存在.

不同土地利用類型河流浮游細菌多樣性和豐富度差異明顯.汛期前，各區域Chao 指數和Shannon-Wiener 指數均表現為UW 區＞VW 區＞AW 區＞CW 區，該排序與人口密度大小排序一致.其原因可能是，UW 區人口密集，居民生活污水排放較多，水體中COD、NO3--N 和TN 濃度均較高，為細菌的生長繁殖提供了良好的生存環境[32-34]；VW 和AW 區人口密度較小，污水排放量少，且VW 區河流匯入AW 區，AW 區細菌多樣性和豐富度均低于VW 區，說明污水排放對浮游細菌的影響程度大于農業面源污染；CW區受人類干擾最小，水質穩定，細菌多樣性和豐富度指數最低.汛期后，UW 區Chao 指數和Shanon 指數下降最多，其次為VW，CW 區下降最少.CW 與UW區屬上下游關系，汛期后CW 與UW 區多樣性指數相近，也論證了河流連通性增大，浮游細菌空間差異性減小；AW 和VW 區相交，但VW 區多樣性指數低于AW 區，說明汛期對人類干擾較強區域的河流(UW 和VW 區)中浮游細菌的多樣性影響較大，且影響程度大于區域的影響.

PCoA 和RDA 分析也得到了類似的結果.汛期前，VW 和UW 區差異明顯，汛期后，VW、UW 和AW區重疊，表明汛期減弱了人類活動對河流浮游細菌空間差異性的影響，該結果與韓雪梅等[30]在老灌河研究浮游細菌多樣性的結果一致.汛期前，影響AW 和UW 區細菌空間差異的主要環境因子分別為COD 濃度、NH4+-N 濃度、WT、EC，以及pH、DO 濃度、NO3--N濃度.汛期后主要為pH、NO3--N 濃度、NO2--N 濃度、TN 濃度和ORP.以上結果也驗證了人類活動(包括氮和磷的輸入)的輕度干擾有利于細菌多樣性增加的結論.另外，已有研究表明受各種外部環境因素和內部物種間相互作用的影響，浮游細菌的時期性演替是一個每年重復的過程[35].

3.2 汛期前后不同土地利用類型河流浮游細菌群落組成變化特征

變形菌門是UW、VW 和AW 區的第1 優勢菌門，在水環境中普遍存在，α-變形菌在氮循環中起到固氮作用[36]，β-變形菌在淡水中占主導地位[13]，γ-變形菌是化能異養菌，介導氫、硫和鐵的生物地球化學循環[37]，還有研究表明變形菌門在參與氮循環、氧化硫化物和降解有機物等方面具有重要作用[38].α-變形菌、β-變形菌和γ-變形菌占UW、VW 和AW 區總變形菌門的66.2% 以上，因此推斷在受人類干擾的UW、VW 和AW 區河流中，變形菌門是物質循環的重要參與者.綠彎菌門和酸桿菌門是已知指示氮素污染物的微生物[39]，該菌門相對豐度均表現出汛期前大于汛期后的特征，與TN 濃度變化一致.浮霉菌門在缺氧條件下能夠利用亞硝酸鹽氧化銨離子脫氮，汛期后NH4+-N 和NO2--N 濃度較高可能是造成該菌門相對豐度相對較高的原因.裝甲菌門是廣泛分布在湖泊尤其是溫泉、熱泉的優勢細菌類群[40]，汛期前高溫天氣為該菌的繁殖提供了良好的環境.

hgcI_clade和CL500-29_marine_group與藍藻密切相關[41]，CW 中hgcI_clade和CL500-29_marine_group的相對豐度均明顯高于其他區域，說明該地區存在藍藻異常增殖的風險；Limnohabitans偏好非酸性環境[42]，在硝酸鹽還原和磷循環中起著關鍵作用[43]，該菌在AW 和VW 區相對豐度較高，與AW 和VW區河流NO3--N 和TP 濃度均呈正相關.Acinetobacter是污水細菌群落的核心類群，常見于人類和動物腸道及分泌物中，被作為人類干擾污染的指示菌種[44]，除CW 外，其余三區Acinetobacter的相對豐度均較高.Thiobacillus通過氧化各種含硫化合物獲得能量，可以為各種水生植物提供硫元素，但也增加了水污染的風險[45]，該菌在汛期后的UW、VW 和AW 區較多且高于汛期前，說明汛期后水污染風險增加.Flavobacterium靠分解有機物生存，使得水質在一定程度得以提高[46-47].汛期后該菌的相對豐度顯著升高，且在UW 區相對豐度最高，說明汛期增加了河流中有機物濃度，該結論與2.1 節一致.另外，Flavobacterium中的某些菌種具有致病作用，集中分布在江河、土壤沉積物和魚的發病組織中[48]，同時它還可以引起醫院內感染，尤其是嬰幼兒更容易感染[49].因此，對于該菌屬也不容忽視，需強防護意識.

3.3 汛期前后不同土地利用類型河流浮游細菌功能預測空間變化特征

河流過量的氮輸入會影響介導氮循環過程關鍵基因的豐度和比例，從而影響各個氮循環過程的速率[50].董志穎等[51]采用PICRUSt 功能預測分析過量氮輸入對細菌群落代謝潛力的影響，發現氮輸入在一定程度上影響了微宇宙中的固氮、硝化、反硝化、異化硝酸鹽還原到銨和同化硝酸鹽還原途徑的關鍵基因.

本文采用PICRUSt2 功能預測分析汛期前后細菌氮代謝潛力的差異，發現參與氮代謝過程的反硝化、氮異化和同化還原基因豐度最高，是河流中生物脫氮的關鍵基因[52]，且脫氮能力在受人類干擾的UW、VW 和AW 區最強.汛期前，有8 個涉及脫氮過程的基因豐度高于汛期后，分別為反硝化基因(nirK、norB和norC)、氮同化基因(napB) 和氮異化基因(narB、nasA、nirA和nirB)；其中反硝化基因在AW區豐度最高，氮同化基因主要在UW 區，氮異化基因主要在VW 區，說明AW 區反硝化能力最強，UW 和VW 區硝態氮主要通過氮同化和氮異化的方式去除.汛期后，有6 個涉及脫氮的基因豐度高于汛期前，分別為反硝化基因(narG、narH和nosZ)、氮同化基因(nasB)和氮異化還原基因(nrfA和nirD).結合基因功能家族預測基因拷貝數和氮循環相關基因豐度分析，汛期后氮代謝能力整體高于汛期前，且反硝化和氮異化還原基因豐度在UW 和VW 區顯著升高，編碼亞硝酸還原酶的nirD與編碼一氧化氮還原酶的norB和norC基因豐度增加最多，結合2.1 節分析，發現汛期后人類干擾區的NO3--N 和TN 濃度均升高，反硝化和硝酸鹽異化還原細菌繁殖，促進了NO2--N 向氮氣的轉化.的轉化.

4 結論

a) 汛期前后清潩河流域不同土地利用類型河流浮游細菌多樣性存在顯著性差異，且汛期對有人類干擾的UW、VW 和AW 區多樣性影響最大.汛期前浮游細菌Shannon-Wiener 指數和Chao 指數高于汛期后，且人口密集的UW 區數值最大；汛期后，浮游細菌群落空間差異性減小，TN、NH4+-N 和COD 濃度增加，浮游細菌多樣性和豐富度指數下降，且UW 區指數下降最多.

b) 差異性分析結果表明，汛期前共17 個門、54個屬存在顯著性差異，汛期后共有12 個門、40 個屬存在顯著性差異，不同土地利用類型是影響細菌群落組成的主要因素.CW 區與藍藻密切相關的hgcI_clade和CL500-29_marine_group豐度最高，存在水體富營養化的風險；UW 區Limnohabitans、Rhodobacter和Rhodobacter豐度最高，氮素污染嚴重；AW 和VW區Flavobacterium、Nitrospira和Thiobacillus 豐度最高，氮磷循環能力最強.

c) PICRUSt2 功能預測分析表明，反硝化、氮同化和異化還原是清潩河流域的主要氮代謝功能，不同土地利用類型河流中氮代謝功能差異明顯，在人類干擾較強的UW、VW 和AW 區氮代謝基因豐度遠高于CW 區.