固定化脂肪酶對鄰苯二甲酸酯污染土壤的修復研究

孫建強,田 露,張安平

(浙江工業大學 環境學院,浙江 杭州 310014)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)因其增塑料效果好、生產成本低和易于加工等特點,被廣泛應用于個人護理產品、食品包裝、醫療器械、農用薄膜的制造與生產中[1-2]。PAEs通常以物理方式與塑料產品結合,在制造、儲存和使用過程中,很容易釋放到空氣、水以及土壤等自然環境里[3]。PAEs已被證明是農業土壤中質量分數最多的有機污染物[4],同時農作物中也能檢測出PAEs,表明農作物會從污染土壤中吸收PAEs,并通過食物鏈對人體健康構成威脅[5]。此外,作為一種典型的內分泌干擾物(EDC),PAEs及其代謝產物有生殖和發育毒性,PAEs長期暴露會導致人類生殖、神經和免疫系統的功能障礙[6]。因此,如何有效去除環境中積累的PAEs已成為土壤修復的重點。

目前已有一些學者對土壤中PAEs的污染開展修復研究工作,主要應用物理、化學和生物修復等技術來改變其特性以降低毒性和環境中的質量濃度,其中生物修復法因其高效、安全和廉價等優點,被認為是修復PAEs污染的主要技術[5]。微生物對PAEs的降解主要由多種酶和蛋白質參與,其中加氧酶和水解酶起著關鍵作用[7]。脂肪酶可作為PAEs酯鍵的水解酶,在特定條件下提高對PAEs的降解[8],然而游離脂肪酶容易受pH和反應溫度等環境條件影響,在實際應用中很容易發生變性導致失活[9]。固定化技術作為一種實用且經濟的綠色技術,可以將酶附著到惰性、不溶材料上以保存酶的活性,提高酶的穩定性和適應性[10]。生物炭作為一種經生物質在限氧供應下緩慢/快速熱解產生的富含芳香族碳的材料,表現出較強的疏水性,具有高比表面積、孔隙度以及碳質量分數豐富等優點,常被作為固定化酶的載體[11-12]。生物炭固定DnBP降解菌株T7,在6 h內將DnBP的去除率從36.83%顯著提高到94.39%[13]。因此,研究制備固定化酶,對于提高降解酶的穩定性和土壤中PAEs的去除率具有重要作用。筆者以鄰苯二甲酸二甲酯(Di-methy phthalate,DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(Di-ethyl phthalate,DEP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(Di-iso-butyl phthalate,DiBP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(Di-n-butyl phthalate,DnBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexyl) phthalate,DEHP)和鄰苯二甲酸二正辛酯(Di-n-octyl phthalate,DnOP)這6種常見的PAEs作為目標污染物,以商品化脂肪酶作為PAEs降解酶,以生物炭作為固定化載體探究固定化脂肪酶的最佳制備條件。同時進一步探究不同環境條件對固定化脂肪酶去除土壤中PAEs的影響,為減少土壤PAEs污染問題提供解決思路。

1 材料和方法

1.1 儀器與設備

三重四級桿型氣相色譜質譜聯用儀(TQ-8040,日本Shimadzu公司);旋轉蒸發儀(德國Heidolph公司);氮吹儀(美國Organomation公司);超純水儀(美國密理博公司);分析天平(德國梅特勒-托利多公司);冷凍干燥機(山東博科生物);超聲波清洗器(SK3210HP,上海科導超聲儀器);旋渦混勻儀(SK-1,常州華普達教學儀器有限公司)。

1.2 實驗試劑與材料

6種PAEs標準品購自上海阿拉丁公司;2種氘代物質DnBP-d4和DEHP-d4購自上海J&K百靈威公司;色譜純的正己烷、丙酮,分析純的無水硫酸鈉(Na2SO4,分析純)、弗羅里硅土(60～100目)購自國藥集團化學試劑公司。

實驗所用玉米秸稈生物炭由浙江省農業科學院提供,通過限氧控溫炭化法在500 ℃環境中熱解3 h制得玉米秸稈生物炭,其理化性質如表1所示。脂肪酶(EC 3.1.1.3)購自上海麥克林生化科技有限公司。所用土壤為天然荷塘泥土,經陽光暴曬后,挑選出大顆粒雜質并過40目篩網備用,pH為7.69,密度為1.22 g/cm3,土壤有機質為18.39 g/kg。

表1 玉米秸稈生物炭的理化性質

1.3 實驗方法

1.3.1 固定化脂肪酶的制備、優化及表征

在100 mL的三角瓶中加入20 mL溶于磷酸鹽緩沖液的脂肪酶溶液和2.0 g生物炭,攪拌均勻后將其振蕩培養一定時間(轉速為120 r/min),之后用真空泵抽濾去除表面水分,并用磷酸鹽緩沖液對固定化脂肪酶表面進行少量多次淋洗,在室溫條件下干燥后儲存于4 ℃冰箱內備用。為了考察不同pH、反應溫度、脂肪酶溶液質量濃度以及固定化時間對酶活的影響,按照表2采用L9(34)正交表設計正交組合實驗,確定獲得最佳固定化酶的制備條件,采用對硝基苯酚法測定固定化脂肪酶活性[14]。

表2 正交實驗因素水平表

通過掃描電子顯微鏡(SEM,Hitachi SU-8020)對生物炭和固定化脂肪酶樣品進行表征分析,首先將樣品分別固定于電膠帶上,進行噴金預處理,然后用10 kV加速電壓的場發射掃描電子顯微鏡觀察拍照。

1.3.2 不同條件下固定化脂肪酶對PAEs降解效果實驗

不同土壤pH對PAEs降解效果的影響:使用醋酸、氧化鈣和不同pH的磷酸鹽緩沖液將土壤pH分別調至5.5,6.5,7.5,8.5,干燥24 h后稱取10 g土壤放置40 mL玻璃離心管中,加入100 mg/L的PAEs混合標準品儲備液50 μL[15]。待有機溶劑揮發干后,添加磷酸鹽緩沖液調節土壤中水的質量分數至45%,在20 ℃黑暗環境中老化24 h后[16],向離心管中加入2%的固定化脂肪酶,旋渦混勻儀120 r/min搖動10 min將土壤與固定化脂肪酶混合均勻,于30 ℃,120 r/min的恒溫振蕩培養箱中反應5 d后取出,向土壤中加入1 mL丙酮終止反應。將玻璃離心管中的土壤冷凍干燥48 h,等待提取分析,每組處理設置3個平行樣。

不同反應溫度對PAEs降解效果的影響:稱取10.0 g pH為7.5的土壤放置于玻璃離心管中,將其分別置于10,20,30,40 ℃,120 r/min的恒溫振蕩培養箱中反應5 d后取出,其他操作同上。

不同固定化酶施加量對PAEs降解效果的影響:稱取10.0 g pH為7.5的土壤放置于玻璃離心管中,分別加入1%,2%,5%(酶與土壤的質量分數)固定化脂肪酶,其他操作同上。

不同土壤中水的質量分數對PAEs降解效果的影響:稱取10.0 g pH為7.5的土壤放置于玻璃離心管中,用磷酸鹽緩沖液調節離心管內水的質量分數至30%,45%,60%,其他操作同上。

1.3.3 固定化脂肪酶對PAEs的降解動力學實驗

在1.3.2節的最佳實驗條件下施加固定化脂肪酶(IL)處理土壤中的PAEs,同時設置對照組(CK),分別在0,1,3,5,7,10,14 d取樣并測定PAEs的質量分數。以PAEs剩余的質量分數C表示固定化脂肪酶對PAEs的影響,其計算式為

(1)

式中:C0為t=0時PAEs的質量分數,μg/kg;Ct為t時PAEs的質量分數,μg/kg。

1.3.4 土壤中PAEs的提取

每份凍干土壤樣品加入DnBP-d4、DEHP-d4以確定土壤中PAEs的回收率,按照V(丙酮)∶V(正己烷)=1∶1的比例加入20 mL提取試劑,經旋渦混勻儀(2 000 r/min,5 min)混合均勻后,靜置于黑暗處12 h以保證充分混合。將該混合物超聲(20 ℃,30 min),離心(2 500 r/min,8 min)以收集上清液,該步驟重復3次。將60 mL上清液混合在燒瓶中,旋轉蒸發并用正己烷濃縮至2 mL。濃縮樣品用經正己烷預處理的玻璃層析柱(填料自下而上為2.0 g無水硫酸鈉,10 g佛羅里硅土)純化。在2 mL棕色進樣小瓶中用平穩的氮氣吹掃洗脫液,最后用正己烷定容至1 mL。在-20 ℃冰箱內密封保存,等待GC-MS/MS進樣分析。

1.4 儀器方法

使用SHIMADZU GC-MS/MS-TQ8040和SH-RXi-5SilMS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱對6種PAEs進行定量分析。樣品(1 μL)以不分流模式注入,載氣(高純氦氣)流速設定為1 mL/min,進樣溫度設置為280 ℃,升溫程序:80 ℃保持1 min;10 ℃/min升溫至180 ℃并保持1 min;8 ℃/min升溫至260 ℃并保持1 min;10 ℃/min升溫至300 ℃并保持5 min。檢測器為電子轟擊離子源(EI源),質譜參數設定:傳輸線溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃。以多反應監測(MRM)模式對PAEs進行檢測分析,相關分析參數如表3所示。

表3 PAEs GC-MS/MS參數

2 結果與討論

2.1 固定化脂肪酶的制備、優化及表征

采用正交實驗法對影響固定化脂肪酶活性的因素進行組合優化,結果如表4所示。對正交實驗結果進行分析,由極差R可以看出固定化脂肪酶制備的主次影響因素:脂肪酶質量濃度>反應溫度>pH>固定化時間。比較k值大小確定最佳制備條件為A2B2C3D2,即最佳制備條件:緩沖溶液pH為7.5,反應溫度為30 ℃,脂肪酶質量濃度為2 g/L,固定化時間為9 h。為了評價固定化酶酶活的穩定性,對最佳制備條件A2B2C3D2進行重復性實驗,固定化脂肪酶酶活分別為1 496,1 501,1 475 μg/g,平均酶活為(1 491±14) μg/g,說明該條件下固定化酶酶活較為穩定。

表4 不同條件下固定化脂肪酶酶活的正交實驗結果

通過掃描電子顯微鏡對實驗所用玉米秸稈生物炭及上述固定化脂肪酶進行表征,結果如圖1所示。生物炭橫截面和側面均觀察到良好的孔隙結構,將脂肪酶進行固定化處理后,在圖1(c,d)中均能觀察到較多小球狀顆粒物,證明脂肪酶通過物理吸附能被有效固定在生物炭的表面、孔隙和裂縫中。

圖1 玉米秸稈生物炭及固定化脂肪酶的掃描電鏡圖

2.2 不同條件下固定化脂肪酶對PAEs的降解效果

圖2(a)顯示了不同pH土壤環境中固定化脂肪酶對PAEs的降解情況。由圖2(a)可知:固定化脂肪酶在pH為7.5和8.5的土壤中均具有較高降解活性,其中當pH=7.5時,DMP,DEP,DiBP,DnBP,DEHP,DnOP的去除率分別可達84.25%,64.88%,66.82%,58.75%,49.00%,34.37%。推測不同PAEs降解快慢的差異可能與其側鏈長度及污染物本身性質有關[17],Peng等[18]發現比起具有相對較長烷基側鏈的DnBP,烷基側鏈較短的DMP和DEP更容易被細菌降解,因此在同樣的環境條件下,固定化脂肪酶可能對結構相對簡單的化合物有更好的促進降解效果,DEHP,DnOP等辛醇水分配系數高的長鏈PAEs則降解較慢。在土壤pH為5.5和6.5的條件下,PAEs的去除率急劇下降,推測土壤pH可能會影響固定化脂肪酶的降解活性。Kaushal等[19]證明了游離和固定化脂肪酶當pH為4～5時均沒有活性,并表明較低pH環境下脂肪酶的結構會發生改變,進而影響脂肪酶的催化活性。此外,土壤pH會影響吸附劑的電荷密度,直接影響污染物在土壤中的去除效果[20]。因此,固定化脂肪酶更適合在中性或偏堿性的土壤中施用,最佳pH為7.5。

a,b,c—不同字母代表不同處理之間具有顯著性差異。

圖2(b)顯示了在10,20,30,40 ℃的反應溫度下固定化脂肪酶對PAEs的降解情況。由圖2(b)可知:隨著反應溫度從10 ℃升高到30 ℃,PAEs去除率得到顯著提高(p<0.05),并在30 ℃達到最高;去除率為34.33%～84.25%。當反應溫度繼續升高到40 ℃時,去除率下降到23.65%～74.79%。推測可能與不同反應溫度下脂肪酶的活性及其反應程度有關。已知不同酶的最佳催化溫度范圍有所差異,低于或超過最佳溫度范圍時,污染物的去除效果會因為酶催化活性的下降而受到影響[21]。Sri等[22]對不同溫度殼聚糖固定化脂肪酶(來源于假絲酵母)的水解活性進行了探究,發現當反應溫度高于最適條件后,即使稍有升高,也會導致脂肪酶大量失活并減弱對底物的水解活性。Kobayashi等[23]發現在脂肪酶降解物質時,不適宜的反應溫度會使酶無法保持良好的蛋白質活性,造成酶催化時間縮短,導致降解效果下降。因此固定化脂肪酶降解PAEs的適宜反應溫度為30 ℃。

圖2(c)顯示了施加1%,2%,5%的固定化脂肪酶對PAEs降解情況的影響。由圖2(c)可知:當酶施加量從1%升高到2%時,PAEs去除率得到顯著提升(p<0.05),以DnBP和DEHP為例,兩者的最高去除率分別可達53.24%和40.72%。隨著固定化酶施加量繼續增大到5%,發現去除率反而隨著酶量的增大而稍有下降。Choi等[24]在0.5%～3.0%酶施加量范圍內,發現隨著酶施加量的增加初始去除率顯著增大,經4 h反應后,酶施加量2%和3%獲得了97%的相似最大去除率。雖然也有一些研究為了獲得更高的物質去除率采用了更高的酶施加量[25-26],但是在本實驗中考慮固定化脂肪酶的施用效益及去除效果,選用2%為最佳固定化酶施加量。

圖2(d)顯示了在土壤中水的質量分數分別為30%,45%,60%的條件下固定化脂肪酶對PAEs去除情況的影響。由圖2(d)可知:PAEs的去除率與土壤中水的質量分數呈正相關。以DnBP和DEHP為例,發現水的質量分數從30%增加到60%的過程中,去除率分別從24.01%和26.15%提高到51.24%和50.72%,且在不同條件下PAEs的去除率有顯著性差異(p<0.05)。這可能是由于土壤中水的質量分數增加會使土壤孔徑增大,促進污染物和固定化脂肪酶在土壤中的分布與結合[27]。Zhang等[28]通過對比玉米、小麥和水稻對土壤中的PAEs的耐受性,發現淹水條件下土壤中的PAEs有更高的去除率,使得水稻對PAEs更具耐受性。此外,土壤中水的質量分數升高還能促進水解反應,提高土壤微生物的活性并加速污染物質的水解[29]。因此,去除PAEs最佳土壤中水的質量分數為60%。

2.3 PAEs降解動力學分析

根據2.2節,在pH為7.5,反應溫度為30 ℃,固定化脂肪酶施加量為2%,土壤中水的質量分數為60%的條件下,探究14 d內固定化脂肪酶對土壤中PAEs的降解,結果如圖3所示。

圖3 固定化脂肪酶對PAEs的降解效果

為了更深入了解固定化脂肪酶對PAEs的降解行為,采用一級降解動力學模型(Ct=C0×e-kt)對PAEs的殘留質量濃度和時間t進行擬合分析[30],其半衰期計算式為

(2)

式中:T1/2為PAEs的半衰期;k為降解速率常數,d-1。降解動力學參數如表4所示。實驗結果表明:固定化脂肪酶(IL)對PAEs表現出良好的去除能力。經固定化脂肪酶處理,14 d后土壤中PAEs的殘留量為初始的15.93%～48.62%。相比長鏈PAEs,短鏈PAEs的去除率更高,這可能是由于PAEs側酯鏈的空間效應不同,較長的側酯鏈會阻礙固定化脂肪酶與PAEs的結合,從而抑制水解反應[17],因此短鏈PAEs更容易發生生物降解,而具有較長酯鏈的PAEs則不易被生物降解。由表5可知:固定化脂肪酶對6種PAEs的降解均符合一級降解動力學模型,經固定化脂肪酶處理,土壤中PAEs的降解速率常數k從0.019～0.035 d-1(CK)顯著增大到0.058～0.145 d-1(IL),降解半衰期從19.80～36.48 d顯著縮短到了4.78～11.95 d,表明固定化脂肪酶的使用可以提高土壤中PAEs的去除率,尤其是短鏈PAEs,對于長鏈PAEs可以考慮先用微生物降解為短鏈PAEs后,再用固定化酶來處理。

3 結 論

以生物炭為固定化載體,通過物理吸附制備固定化脂肪酶,采用正交實驗法確定了固定化脂肪酶的最佳制備條件:pH為7.5,反應溫度為30 ℃,脂肪酶質量濃度為2 g/L,固定化時間9 h,此時固定化脂肪酶酶活最高,平均酶活為(1 491±14) μg/g。將此條件制備的固定化脂肪酶施用到PAEs污染土壤中,發現不同的土壤pH、反應溫度、固定化酶施加量和土壤中水的質量分數都會對PAEs的去除產生影響,實驗結果顯示:在pH為7.5,反應溫度為30 ℃,固定化脂肪酶施加量為2%,土壤中水的質量分數為60%的條件下,PAEs去除效果最好;14 d后土壤中PAEs的殘留量為初始的15.93%～48.62%,降解半衰期從19.80～36.48 d縮短到4.78～11.95 d。實驗結果表明:生物炭固定化脂肪酶具有良好的PAEs去除能力,為固定化脂肪酶在實際污染土壤中的應用提供了依據。后續考慮開展田間實驗探究固定化脂肪酶在實際土壤環境中對PAEs去除的影響,并通過土壤理化性質,土壤微生物種群等指標的變化,進一步證明固定化脂肪酶的應用潛力。