基于HPLC-Q-TOF-MS/MS技術解析蘇木配方顆粒的化學物質組成及裂解規律

顏繼忠,吳亞夢,曾結林,白 芮,張 慧

(浙江工業大學 藥學院,浙江 杭州 310014)

蘇木為豆科植物蘇木CaesalpiniasappanL.的干燥心材[1],原產于東南亞和南印度,常用作天然紅色染料、食用色素,以及作為中藥用于鎮痛消炎和促進血液循環。研究證實這種藥用植物還具有促進血管舒張、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗菌和抗炎等作用[1]。蘇木化學成分復雜,其含有大量的黃酮類成分[2],主要包括黃酮類(Flavones)、黃酮醇類(Flavonol)、二氫黃酮類(Dihydroflavone)、二氫黃酮醇類(Dihydroflavonol)、異黃酮類(Isoflavone)、查爾酮類(Chalcones)、黃烷酮類(Flavanes)、花色素類(Anthocyanidins)和高異黃酮類(Homoisoflavonoids)等[2],以及其他藥理活性成分,如原蘇木素類(Protosappanins)。

蘇木配方顆粒是由蘇木飲片經過提取、濃縮、干燥和制粒等工序,供醫生臨床配方使用的單味中藥濃縮顆粒。目前,關于蘇木的文獻報道主要集中在醇提物的化學成分以及藥理作用研究,對蘇木水提液中的化學成分研究較少,且尚未見蘇木配方顆粒的化學組成文獻報道。筆者利用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術對蘇木配方顆粒進行化學成分分析和裂解規律研究,歸納了查爾酮類、高異黃酮類和原蘇木素類化合物在負離子模式下的裂解規律,為后續蘇木配方顆粒的質量控制提供理論基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

Agilent 1290型高效液相色譜儀(美國Agilent科技有限公司);ACQUITY UPLC(美國Waters公司)-Triple TOFTM 5600+型高分辨質譜系統(美國AB Sciex公司);電子天平(YP502N,上海菁海儀器有限公司),萬分之一電子天平(BS124,賽多利斯科學儀器北京有限公司);旋轉蒸發儀(R210+V700,瑞士Buchi公司);數控超聲波清洗器(KQ-250DE,鞏義市予華儀器有限公司)。

1.2 材 料

色譜級甲醇(TEDIA);色譜級乙腈(TEDIA);娃哈哈純凈水;(±)原蘇木素B(購于成都普思生物科技股份有限公司,批號:PS0359-0020);巴西蘇木素對照品(購于成都普思生物科技股份有限公司,批號:PS0358-0025);蘇木配方顆粒(批次:19507)由浙江貝尼菲特藥業有限公司提供。

2 方 法

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑。以乙腈為流動相A,以純水為流動相B,梯度洗脫:0～<15 min,15% A;15～<30 min,15%～30% A;30～40 min,30%～100% A;流速1.0 mL/min;檢測波長285 nm;柱溫30 ℃;進樣量10 μL。

2.1.2 質譜條件

采用Triple TOF 5600+質譜儀。在ESI正、負離子模式下對供試品溶液進行檢測。一級質譜掃描范圍m/z為100～1 500,二級質譜掃描范圍m/z為50～1 500;負離子模式,霧化氣(GSI)為50 Psi;氣簾氣(CUR)為35 Psi;離子源溫度(TEM)為550 ℃;離子源電壓(IS)為-4 500 V;一級掃描去簇電壓為80 V;碰撞能量為5 V。正離子模式,霧化氣(GSI)為50 Psi;氣簾氣(CUR)為35 Psi;離子源溫度(TEM)為600 ℃;離子源電壓(RS)為+5 500 V;一級掃描去簇電壓為80 V;碰撞能量為5 V。

2.2 溶液的配制

取蘇木配方顆粒適量,研細,取0.1 g,置于具塞錐形瓶中,加甲醇50 mL后稱定質量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)20 min,放冷,再次稱定質量,用甲醇溶液補足減失質量,0.22 μm微孔濾膜過濾備用。

3 結果與分析

3.1 基于HPLC-Q-TOF-MS/MS的蘇木配方顆粒化學成分定性表征

通過優化裂解電壓、掃描參數,確定最佳質譜分析條件,對蘇木配方顆粒在正、負離子條件下進行檢測,總離子流圖如圖1所示。檢測結果表明:在負離子模式下蘇木配方顆粒的響應值較高,特征吸收峰較多,因此,主要研究負離子模式下的化學成分以及推導負離子模式下的質譜裂解規律。通過對照品、參考文獻及相關數據庫的比對分析,共鑒定了61個化合物:包括24個黃酮類成分、6個酚酸類成分、5個巴西蘇木素類成分、4個原蘇木素類成分、4個查爾酮類、4個高異黃酮成分、2個糖類成分、2個生物堿成分、3個二苯類成分、2個香豆素類、3個未知成分、1個苯丙素類和1個氨基酸;其中有12個化合物是首次在蘇木中鑒定的成分;化學成分信息結果如表1所示。按照成分的不同母核結構,將蘇木中的查爾酮類、高異黃酮類和原蘇木素類化合物進行歸納總結(圖2),并將對這3類典型藥理活性化合物進行裂解規律解析。

表1 蘇木配方顆粒化學成分信息表

圖1 蘇木配方顆粒總離子流圖

圖2 蘇木中查爾酮類、原蘇木素類和高異黃酮類成分的基本骨架

3.2 查爾酮化合物的裂解規律解析

查爾酮化合物被認為是黃酮類化合物和異黃酮類化合物的前體,屬于芳香族烯酮類化合物,基本結構為1,3-二苯基-2-烯-1-酮[29]。蘇木配方顆粒中共鑒定4個查爾酮類化合物,分別為化合物26,29,39,47。查爾酮類裂解時會有典型的中性丟失,包括H2O(18Da)、CO(28Da)等,同時會產生m/z為135[C8H7O2]-和91[C6H3O]-的典型碎片離子。B環取代基和位置均相同時區別在于A環取代基的類型和位置,從而影響裂解。對于B環上含有羥基取代的查爾酮類,由于間位羥基與環外的雙鍵以及羰基的共軛受阻,從而使得生成的負離子穩定性不強,因而C-3羥基優先丟失。若A環上連有甲氧基,甲氧基作為推電子基團,提高了B環的電子云密度,增強了共軛效應,因而相對穩定,優先丟失H2O(18Da),后續進一步脫去·CH3碎片離子且易與B環一起發生斷裂。受2′位置羥基的影響,B環易丟失,若A環上存在羥基,首先其氫重排后再失去CO(28Da)碎片離子,且取代基種類會影響碎片的豐度。

化合物29(Butein,紫鉚因)在負離子模式下丟失一分子H,得到的準分子離子峰m/z為271.060 3[M-H]-,在準分子離子峰的基礎上,α裂解產生m/z為135.043 9[M-H-C7H4O3]-或91.020 9[M-H-C9H8O4]-的碎片離子,與化合物39的裂解途徑基本相似。化合物39(Sappanchalcone,蘇木查爾酮)在負離子模式下丟失一分子H,產生準分子離子峰m/z為285.075 8[M-H]-,在準分子離子峰的基礎上,B環失去一分子·CH3所產生的m/z為270.052 2[M-H-CH3]-,B環丟失得到m/z為161.023 2[M-H-C7H8O2]-的碎片離子。同時也有可能斷裂產生m/z約為135[C8H7O2]-或91[C6H3O]-的碎片離子。可能裂解途徑如圖3所示。

圖3 蘇木中查爾酮類在負離子模式下的裂解規律

3.3 高異黃酮類化合物的裂解規律解析

高異黃酮類是比異黃酮類的B、C環之間多1個亞甲基的特殊黃酮類,因亞甲基的存在容易導致C-3處的斷裂,從而產生失去B環的特征碎片離子[30]。取代基一般為—OH、—OCH3,共有8種類型,其中高異黃酮類(Ⅳ)的結構特征為母體結構為3-羥基二氫高異黃酮,A環7位為羥基取代;高異黃酮類(Ⅷ)的結構特征為母體結構是由A、B、C和D四環構成,并且C-4沒有連接羰基。在蘇木中,根據C-4位取代基的不同而劃分為蘇木酮類和蘇木醇類。蘇木配方顆粒中共鑒定出4個高異黃酮類成分,分別為化合物9,13,18,25。高異黃酮類發生的中性碎片丟失如CO(28Da)、CH3(15Da)和H2O(18Da)等,生成m/z為135[C8H7O2]-、163[C9H7O3]-和179[C9H7O4]-等典型碎片離子。當C環上有甲氧基取代時,則會產生中性丟失CH3(15Da),且優于B環(Ⅷ型)發生丟失。當C環上無甲氧基取代時,容易發生C環的斷裂,C環開環變為五元環,以及A環本身也會發生裂解反應。

化合物9(Episappanol,表蘇木醇)在負離子模式下丟失一分子H,得到的準分子離子峰m/z為303.085 7[M-H]-,在準分子離子峰的基礎上,B環(Ⅳ)直接斷裂得到m/z為179.033 4[M-H-C7H8O2]-和123.044 2[M-H-C9H8O4]-的碎片,B環丟失,產生m/z為148.016 0[M-H-C8H10O3]-的亞穩離子,經誘導裂解后產生m/z為135.044 4[M-H-C8H7O4]-的碎片離子,失去一分子·CH2,所產生的m/z為121.021 9[M-H-C9H9O4]-。化合物18(4-O-Methylsappanol,4-O-甲基蘇木素)在負離子模式下丟失一分子H,得到的準分子離子峰m/z為317.076 4[M-H]-,失去一分子·CH3得到302.079 9[M-H-CH3]-,失一分子H2O得到284.065 6[M-H-CH3-H2O]-的碎片離子,C環開環斷裂得到m/z為135.044 2[M-H-C9H10O4]-的碎片離子。化合物25(Sappanone B,蘇木酮B)在負離子模式下丟失一分子H,得到的準分子離子峰m/z為301.071 1[M-H]-,在準分子離子峰的基礎上,B環(Ⅳ型)斷裂得到m/z為179.033 4[M-H-C7H6O2]-,和豐度較低m/z為135.044 7[M-H-C8H6O4]-的碎片離子。失去一分子CO后得到151.039 0[M-H-C8H6O3]-。m/z為179.033 8[M-H-C7H6O2]-失去·C2H2得到m/z為109.030 5[M-H-C10H8O4]-的碎片離子。化合物13(Brazilin,巴西蘇木素)在負離子模式下丟失一分子H得到的準分子離子峰m/z為285.074 7[M-H]-,在準分子離子峰的基礎上,丟失一分子H2O,得到m/z為267.064 5[M-H-H2O]-的碎片離子,m/z為163.037 9[M-H-C7H6O2]-由六元環C環與五元環D環直接斷裂形成。丟失一分子CO,所產生的m/z為135.044 2[M-H-C8H6O3]-,同時也有可能C環開環斷裂產生m/z為121.028 9[M-H-C9H8O3]-和163.037 9[M-H-C7H6O2]-的碎片離子。易發生斷裂的母核位置以及可能裂解途徑如圖4所示。

圖4 蘇木中高異黃酮類在負離子模式下的裂解規律

3.4 原蘇木素類化合物的裂解規律解析

原蘇木素類是蘇木中特有的一類成分,它們具有一個基本的母核結構。蘇木配方顆粒中共鑒定出4個原蘇木素類成分,分別為化合物7,11,15,40。其中,化合物21是化合物11的衍生物,化合物40由化合物7與化合物11聚合形成。原蘇木素類發生的中性碎片丟失主要以H2O(18Da)為主,且會產生特征碎片離子,其m/z為229[C13H9O4]-或211[C13H7O3]-。C環上的R基團并未與苯環共軛,因此性質相對于其他環上的基團較為活潑,容易丟失。同時C環由于跨環張力,八元環相對不是很穩定,易發生開環行為,或形成六元環化合物。當C環上連有甲氧基時,則優于其他R基團發生中性丟失,或者同時發生斷裂。

化合物11(Protosappanin B,原蘇木素B)在負離子模式下丟失一分子H,得到的準分子離子峰m/z為303.086 7[M-H]-,在準分子離子峰的基礎上,丟失一分子H2O,得到m/z為285.076 6[M-H-H2O]-的碎片離子,C環斷裂成得到m/z為231.064 3[M-H-C3H4O2]-和243.064 8[M-H-C2H4O2]-的碎片離子,m/z為243.064 8[M-H-C2H4O2]-閉環得到m/z為211.039 1[M-H-C3H8O3]-的碎片離子。化合物7(Protosappanin C,原蘇木素C)在負離子模式下丟失一分子H,得到的準分子離子峰m/z為301.069 6[M-H]-,在準分子離子峰的基礎上,丟失一分子H2O,得到m/z為283.059 0[M-H-H2O]-的碎片離子,C環斷裂所生成的m/z為229.049 6[M-H-C3H4O2]-,丟失一分子H2O,得到m/z為211.038 8[M-H-C3H6O3]-的碎片離子。化合物40(Protosappanin E1/E2,原蘇木素E1/E2)在負離子模式下丟失一分子H,得到的準分子離子峰m/z為585.140 2[M-H]-,在準分子離子峰的基礎上斷裂,得到m/z為283.060 0[M-H-C16H14O6]-的碎片離子,與化合物7中的m/z為283[M-H-H2O]-相吻合,C環開環斷裂形成m/z為229.049 4[M-H-C19H16O7]-的碎片離子。易發生斷裂的母核位置以及可能裂解途徑如圖5所示。

圖5 蘇木中原蘇木素類在負離子模式下的裂解規律

4 結 論

采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術解析了蘇木配方顆粒中化學成分以及裂解規律。根據化合物的一級、二級質譜信息,通過對照品、參考文獻及相關數據庫的比對分析,共鑒別了61個化合物,包括24個黃酮類成分、4個原蘇木素類成分、4個高異黃酮類成分和4個查爾酮類成分等。總結推導了查爾酮類、高異黃酮類和原蘇木素類的質譜裂解規律。查爾酮類主要的裂解途徑為脫掉中性分子以及丟失B環,主要產生m/z為135[C8H7O2]-或91[C6H3O]-的特征碎片離子;高異黃酮類主要的裂解途徑為脫去H2O,脫去甲氧基、B環斷裂,產生m/z為135[C8H7O2]-、163[C9H7O3]-和179[C9H7O4]-等特征碎片離子;原蘇木素類主要的裂解途徑為脫去H2O、C環斷裂,產生m/z為229[C13H9O4]-或211[C13H7O3]-的特征碎片離子。還推導出了查爾酮類、原蘇木素類化合物在負離子模式下的裂解規律,并總結了3類化合物在負離子模式下的特征碎片離子,研究成果將有助于蘇木配方顆粒的化學物質基礎研究,同時為該品種的科學質量控制奠定基礎。

本文得到了浙江工業大學研究生實踐基地建設項目(GZ21231160006,GZ21881160011)的資助。