D3胚胎卵裂球數目與胚胎發育潛能和整倍性的相關性研究

郭娜，田文曲，李悅含，談慧平，熊婷，陳雯，吳黎，馬冰馨，任新玲

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院生殖中心,武漢 430030)

在輔助生殖技術(ART)中,胚胎選擇對于優化活產率和縮短受孕時間具有重要意義。近年來,選擇性單囊胚移植逐漸成為一種廣泛應用的臨床策略,可以獲得較高的臨床妊娠率和較低的多胎妊娠率。但在臨床工作中,對于高齡、卵巢儲備功能低下、獲得胚胎數目有限以及反復囊胚培養失敗等患者,則更適合進行卵裂期胚胎移植[1]。囊胚培養技術不僅費時費力,延長體外培養時間也可能會增加胚胎表觀遺傳學改變[2]。因此,如何從眾多卵裂期胚胎中選擇最有可能進入囊胚階段的胚胎進行移植并獲得健康活產兒是當前關注的焦點。眾所周知,大部分早期妊娠丟失和反復著床失敗是由胚胎非整倍體造成的,而胚胎植入前非整倍體遺傳學檢測(preimplantation genetic testing for aneuploidy,PGT-A)技術可以通過篩選整倍體胚胎進行移植,從而改善妊娠結局和預防出生缺陷[3]。本研究應用高通量測序技術,基于PGT-A相關數據,評估卵裂期胚胎卵裂球數目與胚胎整倍性的相關性,從而為臨床單胚胎移植策略的推廣提供參考。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2018年1月至2021年12月在本院生殖中心行ART助孕且進行PGT-A的患者臨床資料。

納入標準:入組夫婦均符合PGT-A指征:(1)女方高齡(≥38歲);(2)復發性流產;(3)反復植入失敗;(4)不良孕產史等。

排除標準:(1)夫妻雙方中有一方或雙方均存在染色體異常;(2)單基因病行胚胎植入前單基因遺傳學檢測患者;(3)因細胞量不足或擴增失敗的周期;(4)對同一囊胚進行二次活檢的周期;(5)患者因個人原因中途放棄行PGT-A治療周期。

根據納入/排除標準,本研究共納入261個治療周期,包括920枚活檢囊胚。本研究通過本院醫學倫理委員會批準,批準編號為[2021]倫審字(S221)號,夫妻雙方均知曉并同意。

二、研究方法

1.分組:本研究對920枚活檢囊胚資料進行回顧性分析,根據其D3胚胎卵裂球細胞數不同進行分組,分為4細胞組、5細胞組、6細胞組、7細胞組、8細胞組、9細胞組、10細胞組及≥11細胞組;再將D3卵裂球細胞數進行合并分組,分為:≤7細胞組、8細胞組、9～10細胞組和≥11細胞組。評估各組后續獲得優質囊胚、整倍體囊胚的機會,并同時分析各組間臨床結局。

2.控制性促排卵:根據患者年齡、卵巢激素水平及儲備情況采用相應的促排卵方案,當陰道B超監測下至少有一個主導卵泡直徑≥18 mm時給予肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG,珠海麗珠)8 000～10 000 U或重組人絨毛膜促性腺激素(艾澤,默克雪蘭諾,瑞士)0.25 mg扳機,于扳機后36～38 h經陰道超聲指導下取卵。

3.受精、胚胎培養及評估:所有行PGT-A周期均行卵胞漿內單精子注射(ICSI)受精,ICSI后將受精卵置于Time-lapse培養箱中培養,所采用培養液來自瑞典Vitrolife公司的G系列序貫培養液,16～18 h觀察受精情況,于受精后第2天(D2)、第3天(D3)記錄胚胎卵裂球細胞數、碎片化程度、細胞均一性。擬行PGT-A的胚胎均需培養至囊胚階段。采用Gardner評分體系,選擇囊胚評級在3BC及以上的可用囊胚進行活檢。

4.囊胚活檢、冷凍及PGT-A檢測:使用HAMILTON激光操作系統對囊胚進行滋養外胚層細胞活檢。用激光在內細胞團對側的透明帶打孔,打孔大小以剛好插入活檢針為宜,迅速插入活檢針吸取3～5個滋養層細胞送檢測。活檢后的囊胚即刻進行玻璃化冷凍,并單管單胚冷凍儲存于液氮中。囊胚冷凍液采用日本KITAZATO生物制藥有限公司,按照本中心常規步驟進行囊胚冷凍。高通量測序:采用胚胎植入前遺傳學篩查文庫制備試劑盒(億康基因公司)進行樣品制備、擴增,測序由億康基因公司負責完成。

5.復蘇移植及隨訪:選擇本中心常規子宮內膜準備方案準備內膜。根據PGT-A檢測結果,挑選形態正常且染色體遺傳學檢測無異常的胚胎進行單囊胚解凍移植。囊胚復蘇液采用日本KITAZATO公司生產的商品化試劑套盒。囊胚移植后4周超聲提示有孕囊及原始心管搏動者為臨床妊娠;孕16～20周行羊水穿刺檢查胎兒染色體狀態。

6.觀察指標:整倍體率=整倍體囊胚數/活檢囊胚數×100%;優質囊胚率=優質囊胚數/囊胚總數×100%;臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/囊胚移植周期數×100%;流產率=流產周期數/囊胚移植周期數×100%;活產率=活產周期數/囊胚移植周期數×100%。

三、統計學分析

結 果

一、患者基本資料

本研究共納入261個PGT-A治療周期,總共920枚活檢囊胚。患者的一般資料及實驗室參數詳見表1。

表1 患者一般情況及實驗室參數[(-±s),n(%)]

二、D3卵裂球數目對囊胚質量的影響

回顧性分析920枚活檢囊胚資料,根據其D3胚胎卵裂球細胞數不同進行分組。組間分析發現:5細胞、6細胞、7細胞及10細胞組優質囊胚率顯著低于8細胞組(P=0.00),調整女方年齡因素以后,差異仍有顯著性(P=0.00);其他各組與8細胞組相比,優質囊胚率無顯著差異(P>0.05),調整女方年齡后,差異仍無顯著性(P>0.05)(表2)。

合并分組后,≤7細胞組和9～10細胞組優質囊胚率顯著低于8細胞組(P<0.05),調整年齡因素以后,差異仍有顯著性(P<0.05);≥11細胞組優質囊胚率與8細胞組差異并無顯著性(P=0.51),調整女方年齡后,仍無顯著差異(P=0.45)(表2)。

三、D3卵裂球數目對囊胚整倍體率的影響

與8細胞組相比,其余各組囊胚的整倍體率均無顯著性差異(P>0.05),調整年齡后,各組間囊胚整倍體率差異仍無顯著性(P>0.05);合并分組后,雖然隨著細胞球發育速度的增快,囊胚整倍體率增加,但各組間差異并無顯著性(P>0.05),調整年齡混雜因素后,各組間差異仍無顯著性(P>0.05)(表3)。

表3 不同D3卵裂球數目組間的整倍體率比較(%)及多因素分析

四、不同D3卵裂球數目組整倍體囊胚移植后的妊娠結局比較

經PGT-A檢測出的整倍體囊胚共473枚,擇期進行單個整倍體囊胚移植共208個周期,活產情況隨訪至2022年8月。統計結果顯示,隨著卵裂球細胞數的增加,臨床妊娠率和活產率呈上升趨勢,但各組間無顯著性差異(P>0.05);合并分組后,≥11細胞組臨床妊娠率和活產率均高于其他各亞組,≤7細胞組臨床妊娠率和活產率則低于其他各亞組,但差異均尚無統計學意義(P>0.05)(表4)。

表4 不同D3卵裂球數目組間妊娠結局的比較(%)

討 論

近年來,國內外越來越多的專家推薦選擇性單胚胎移植策略[4]。如何準確評估并挑選最具發育潛能的胚胎,一直是提高單胚胎移植成功率的難點。目前,單囊胚移植在保證較高妊娠率的同時降低了多胎妊娠率,但是延長體外培養時間可能會增加周期取消、早產及表觀遺傳改變等風險[2,5],而且并不是所有的患者都選擇接受這種額外的延時培養策略[6]。因此,D3單個卵裂期胚胎移植仍然是當前許多國內外生殖中心使用的首選方案。通常根據細胞數量、對稱性和碎片程度選擇胚胎進行移植。胚胎發育速度被認為是評估體外胚胎質量的可靠指標[7]。大量研究表明,早期胚胎的快速分裂被認為是“混亂的”,大于8細胞的胚胎具有較高的非整倍體率;發育過快或緩慢的胚胎發育潛能較差,通常不被選擇移植[8-9]。2022年最新研究發現,快速分裂的卵裂期胚胎具有更高的活產率[7]。因此,建立一種新的輔助選擇標準來評估卵裂期胚胎的發育潛能具有重要意義。

非整倍體是導致胚胎著床失敗和妊娠丟失的主要原因,隨著囊胚培養技術的發展和活檢技術的進步,胚胎植入前遺傳學篩查(PGT-A)成為區分染色體正常與否的現代標準,從而實現提高妊娠率、降低流產率的目的[10]。既往研究將卵裂期胚胎發育與非整倍體相聯系,但大部分采用卵裂球活檢技術,通常存在較高的非整倍體和嵌合型風險。而且,熒光原位雜交(FISH)技術、單核苷酸多態性微陣列(SNP array)或微陣列比較基因組雜交技術(array CGH)等,在分析整個染色體組、識別較小的缺失和重復以及檢測嵌合體方面的能力有限,NGS作為近年來新出現的高通量測序技術,憑借較低的測序成本和數據分析軟件的優化,在PGT-A中有廣泛的應用前景[11]。

Pons等[12]利用aCGH技術回顧性分析4 028枚胚胎的PGT-A數據,證實>11細胞胚胎的整倍性與8細胞胚胎整倍性相似。Campbell等[13]發現與發育延遲的胚胎相比,較快到達緊湊化和囊胚化階段的胚胎更有可能成為整倍體。Petersen等[14]開發了一種新算法,根據D3胚胎形態學數據預測囊胚質量,與D3<8細胞胚胎相比,D3>8細胞的胚胎被給予更高的發育評分。Minasi等[15]利用延時成像技術評估928枚囊胚的發育潛能,發現與非整倍體囊胚相比,整倍體囊胚從3到4細胞的分裂明顯更快,4細胞期顯著提前,囊胚擴張和孵化明顯更快。王江等[16]觀察到,早期異常卵裂并不影響囊胚染色體整倍性,也不影響解凍移植后的臨床妊娠率和流產率。Luna等[17]回溯性研究表明發育較快的胚胎(≥10細胞)比中等分裂的胚胎更有可能成為高質量的4AA或5AA級囊胚。本研究借助NGS高通量測序平臺及滋養層細胞活檢技術,發現8細胞胚胎發育為優質囊胚比例最高;D3≥11細胞卵裂期胚胎更有可能發育成囊胚并接受滋養外胚層細胞活檢,并且具有較高的整倍體率和顯著的發育能力,與上述研究結果一致。然而,Kroener等[18]評估了卵裂球數量和非整倍體的關系,發現D3>9細胞的胚胎與非整倍體率增加有關,考慮可能是由于胚胎發育速度過快導致在正確發育階段無法啟動胚胎基因組的激活,從而導致染色體異常或表觀遺傳印記的異常。Kong等[19]則認為較高的直接卵裂行為,細胞周期的同步性缺乏導致了9～11細胞的囊胚形成率下降。

本研究也存在一定局限性。雖然PGT-A技術能夠輔助篩選出發育潛能較差的非整倍體胚胎,并且在目前的幾種評估胚胎發育潛能的方法中是最準確的指標[20]。但是這項技術可能會使胚胎受到侵入性、假陽性以及嵌合體因素的影響。此外,本研究屬于單中心、小樣本量研究,未來的研究應致力于識別精確的形態動力學特征,結合基因組和非基因組標記,創建多維預測數據,為預測胚胎植入、優化胚胎選擇、改善患者預后的決策支持工具提供動力。

綜上所述,本研究結果表明隨著卵裂球數目增加,優質囊胚率和整倍體率都會有所改善,活產率有所增加。在臨床實踐中除了8細胞胚胎以外,也可優先考慮移植快速分裂的胚胎。優化D3胚胎挑選策略,對于提高胚胎利用率、改善單胚胎移植效率、縮短抱嬰回家時間具有重要的指導意義。