精子核成熟度與精液質量的相關性分析

宋明哲，黃文思，2*，葉麗君，2，彭月琴，梁錦明，肖煒強，曾勇，2

(1.深圳中山泌尿外科醫院泌尿外科,深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室,深圳中山生殖與遺傳研究所,深圳 518045;2.廣東省圍著床期生殖免疫工程技術研究中心,深圳 518045)

精子發生晚期,精子染色質經歷核蛋白組型轉換過程,約85%的組蛋白被魚精蛋白替換[1]。魚精蛋白是富含精氨酸和半胱氨酸的堿性蛋白。帶正電荷的精氨酸與帶負電荷的DNA緊密結合,以及蛋白分子內和蛋白分子間通過半胱氨酸氧化形成二硫鍵,使染色質高度凝聚,精子核隨之縮小6～20倍[2-3],這是精子核成熟的表現。精子核成熟是保障精子染色質結構穩定性的重要過程,這有助于染色質抵抗化學和物理損傷從而確保遺傳物質高保真地傳遞給后代[2,4]。核成熟度低的精子魚精蛋白替換組蛋白不充分,致使組蛋白滯留過量從而降低染色質凝聚。這些精子易受氧化應激等的損傷,導致DNA碎片指數(DFI)升高,并可能存在膜結構、運動能力等的缺陷[5-7]。有研究報道,精子核成熟度低還與精子濃度、總數和前向運動精子百分率(PR)降低以及形態學改變有關[8-9]。因此,評估精子核成熟度可有助于精液參數異常的病因查找。然而,目前缺乏檢測精子核成熟度的明確指征。本研究通過苯胺藍染色法評估精子核成熟度,比較不同精子核成熟度組間精液參數的差異及其異常率的變化,同時分析精子核成熟度與精液參數的相關性,以期為臨床檢測和解釋精子核成熟度參數提供參考依據。

資料和方法

一、研究對象

收集2022年1月1日至12月31日在深圳中山泌尿外科醫院進行精子核成熟度檢測的男性患者506人次,剔除重復檢測該項目的患者83人次,最終納入423例男性患者為研究對象進行回顧性分析。

納入標準:同時進行了精子核成熟度及其他精液參數檢測的患者。排除標準:精液濃度<2×106/ml,以及經睪丸或附睪取精患者。本研究中每位患者的精液項目檢測均使用同一份精液標本完成。本研究通過深圳中山泌尿外科醫院倫理委員會審批(批號:2021醫倫快審第012號)。

根據精子核成熟度不同將患者分為3組:低成熟組(核蛋白不成熟精子百分率>30%)45例;中成熟組(15%<核蛋白不成熟精子百分率≤30%)242例;高成熟組(核蛋白不成熟精子百分率≤15%)136例。

二、研究方法

1.精液常規參數分析:參照《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版[10]的標準采集和處理精液標本。男性患者禁欲2～7 d后,手淫取精。利用電子天平(深圳衡之寶)稱量精液,計算精液體積。精液液化后,取10 μl稀釋的精液滴于Makler計數池(Sefi-Makler,以色列)后放于相差顯微鏡(尼康,日本)載物臺,通過計算機輔助精液分析操作系統(CASA系統,Microptic,西班牙)進行精子常規參數分析,包括精子總數、精子濃度、前向運動精子百分率(PR)、非前向運動精子百分率(NP)、不活動精子百分率(IM)。精液樣本使用Diff-Quik染色液(深圳華康)進行精子染色,在光學顯微鏡下人工分析精子形態學特征,包括正常形態精子百分率、頭部缺陷精子百分率、頸部和中段缺陷精子百分率、主段缺陷精子百分率。精液常規參數的正常范圍分別為:精子總數>39×106條/每次射精,精子濃度≥15×106條/ml,前向運動精子百分率≥32%,正常形態精子百分率≥4%。

2.苯胺藍染色法分析精子核成熟度:使用苯胺藍-伊紅染色液試劑盒(深圳華康)檢測核蛋白不成熟精子百分率,按照試劑盒說明書方法操作。取5 μl濃度為20×106條/ml精子懸液采用拉薄技術涂片,涂片干燥后甲醇固定,苯胺藍液染色,洗掉苯胺藍液,伊紅液染色,洗掉伊紅液,干燥后在油鏡下觀察。由于不成熟精子的核蛋白主要為富含賴氨酸的組蛋白,苯胺藍與賴氨酸結合生成紫藍色化合物,精子被染成藍色,而成熟精子核蛋白主要為魚精蛋白則被伊紅染成紅色。計算核蛋白不成熟精子百分率(%)[藍色精子數/(藍色精子數+紅色精子數)×100%]。

3.精子染色質結構分析法測定DFI和高DNA染色(HDS)值:使用精子核完整性染色試劑盒(安徽安科生物)進行精子染色后,通過流式細胞儀(深圳邁瑞)檢測綠色和紅色熒光,計算DFI(%)[紅色熒光精子數/(綠色熒光精子數+紅色熒光精子數)×100%]和HDS(%)[高綠色熒光精子數/(綠色熒光精子數+紅色熒光精子數)×100%]。DFI的正常范圍為≤30%,HDS的正常范圍為≤15%。

4.精子頂體酶活性檢測:使用精子頂體酶活性定量檢測試劑盒(南京欣迪)聯合酶標儀(BioTek Eon,美國)檢測頂體內精氨酸酰胺酶活性,該指標能間接反映頂體酶活性。精子頂體酶活性的正常范圍為≥36 IU/106。

5.活性氧熒光探針測定精子活性氧(ROS)水平:使用精子活性氧試劑盒(安徽安科生物)進行精子染色后,通過流式細胞儀檢測熒光強弱,鑒別ROS含量正常精子和ROS過量精子,計算攜帶過量ROS精子的比例。ROS過量精子百分率的正常范圍為<40%。

三、統計學分析

結 果

一、研究對象的基本情況

本研究納入的423例患者中,核蛋白不成熟精子百分率≤15%(高成熟組)的136例,占比32.15%;15%<核蛋白不成熟精子百分率≤30%(中成熟組)的242例,占比57.21%;核蛋白不成熟精子百分率>30%(低成熟組)的45例,占比10.64%。高成熟組的平均年齡為(35.49±6.18)歲,中成熟組為(34.43±5.88)歲,低成熟組為(33.20±4.12)歲;低成熟組的平均年齡顯著低于高成熟組(P<0.05)。

二、不同精子核成熟度組間精液常規參數及形態學比較

各組間精液常規參數比較,低成熟組的精子總數、精子濃度顯著低于高成熟組(P<0.05);低成熟組和中成熟組的PR顯著低于高成熟組(P<0.05),IM顯著高于高成熟組(P<0.05);各組間的NP無顯著性差異(P>0.05)。正常形態精子百分率隨著核成熟度的降低而顯著降低(P<0.05),頭部缺陷精子百分率隨著核成熟度的降低而顯著升高(P<0.05),頸部和中段缺陷、主段缺陷精子百分率各組間無顯著性差異(P>0.05)。各組的精液常規參數及形態學結果詳見表1。

表1 不同精子核成熟度組的精液常規參數比較(-±s)

三、不同精子核成熟度組間精子DFI、頂體酶活性、ROS等參數比較

低成熟組和中成熟組的DFI和HDS顯著高于高成熟組(P<0.05),低成熟組的HDS顯著高于中成熟組(P<0.001);各組間精子頂體酶活性和ROS比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 不同精子核成熟度組間精子DFI、頂體酶活性、ROS等參數比較(-±s)

四、不同精子核成熟度組間精液指標異常率比較

比較各組間精液參數異常率(異常例數/總例數×100%)發現,低成熟組的精子總數、精子濃度和HDS異常率顯著高于高成熟度組(P<0.05),低成熟組的HDS異常率顯著高于中成熟度組(P<0.001),正常形態精子百分率的異常率隨著精子核成熟度的降低顯著升高(P<0.05)(表3)。

表3 不同精子核成熟度組間精液參數異常率比較(%)

五、精子核成熟度與精液質量的相關性

分析組間差異具有統計學意義的精液參數與精子核成熟度的相關性,結果顯示核蛋白不成熟精子百分率與PR和正常形態精子百分率呈負相關(P<0.05),與IM、頭部缺陷精子百分率、DFI和HDS呈正相關(P<0.05),與精子總數和精子濃度無顯著相關性(P>0.05);由于男方年齡是影響精液質量的主要因素之一,因此,校正男方年齡后再次分析精液參數與精子核成熟度的相關性,結果發現除精子濃度與精子核成熟度未表現出明顯相關性(P>0.05)外,其余精液參數均與精子核成熟度相關(P<0.05),且相關系數絕對值(|r|)增大(表4)。

表4 核蛋白不成熟精子百分率與精液質量的相關性分析

通過線性回歸進一步驗證精子核成熟度與精液質量的相關性。線性回歸結果同樣顯示核蛋白不成熟精子百分率與PR和正常形態精子百分率呈負相關(P<0.05),與IM、頭部缺陷精子百分率、DFI和HDS呈正相關(P<0.05),與精子總數和精子濃度無明顯相關性(P>0.05)(表5)。

表5 核蛋白不成熟精子百分率與精液質量的線性回歸分析結果

討 論

精子核蛋白組型轉換是魚精蛋白替換組蛋白形成高度凝聚染色質的過程,是精子核成熟的表現。染色質高度濃縮是父系生殖所必需的過程,有利于形成小體積的長形精子,使精子在女性生殖道高效游動;能有效保護遺傳物質免受物理和化學損傷,抑制轉錄從而保障遺傳物質的穩定性;還有助于受精后父源染色質快速解聚和重編程。與正常生育男性相比,男性不育患者精子核成熟度顯著降低[11-12]。因此,評估精子核成熟度對男性不育的病因分析具有重要意義。目前,由于缺乏關于精子核成熟度臨床適應癥和治療方案的專家共識,臨床醫生針對該指標的診治存在較多疑惑,例如哪些患者需要檢查,什么因素引起該指標異常,如何提高治療效果等。因此,本研究通過分析精子核成熟度與精液質量的相關性,旨在為臨床檢測精子核成熟度的適應癥及檢測結果評估提供依據。

本研究結果顯示精子核成熟度與精子DNA完整性相關(P<0.05),其中與HDS顯著相關(表4、表5),且隨著精子核成熟度降低HDS及其異常率顯著升高(P<0.05)。目前,關于精子核成熟度與HDS相關性的研究較少,兩者相關的可能原因尚未闡明。我們認為HDS是吖啶橙染料與精子DNA可接觸性增加的結果,而染料與DNA可接觸性的變化與染色質凝聚程度相關,苯胺藍染色法是通過檢測組蛋白水平間接反映染色質凝聚程度,這可能是HDS和苯胺藍染色結果顯著相關的原因。Zini等[13]證實組蛋白H2B水平增加與HDS升高相關。近年來,有研究者發現HDS與評估精子核成熟度的苯胺藍染色法、色霉素A3染色法和甲苯胺藍染色法的檢測結果弱相關[14],而且HDS隨男性年齡增加而降低[15-16],因此有學者提出HDS不是評估精子核成熟度的可靠指標[17]。Ménézo[18]提出HDS隨年齡增加而降低是因為高齡引起的脂質過氧化和谷胱甘肽氧化是魚精蛋白形成二硫鍵與DNA緊密結合所需。本研究結果與上述文獻不一致的原因可能有:臨床研究的研究對象、樣本量和研究設計等不同可能導致結論存在差異;另外,本研究沒有直接分析HDS精子群的核成熟度情況。之前有學者使用小鼠開展實驗研究,結果提示DFI水平反映了染色質凝聚程度[5];人類精子相關研究也提示精子核成熟度與DFI顯著相關[13]。本研究中同樣發現核蛋白不成熟精子百分率與DFI呈正相關,但相關性弱。精子組蛋白核型轉換需要DNA結構的空間改變,內源性核酸酶在精子DNA斷裂和修復中發揮重要作用,當內源性核酸酶系統效率不足時,必需的DNA斷裂減少并且未被修復的DNA碎片增加,隨后導致組蛋白核型轉換異常和DFI增多[19]。Noblanc等[20]提出核不成熟精子的染色質松散,易受氧化應激損傷,導致DFI升高,精子凋亡增多。本研究旨在分析精子核成熟度是否與ROS有關,結果發現不同精子核成熟度組間的ROS無顯著差異,提示不同精子核成熟度患者的ROS可能是同質的;但低成熟組和中成熟組患者的DFI顯著高于高成熟組,提示在相同ROS水平時,核成熟度低的精子可能對氧化應激的易感性更高,導致DFI升高。這也間接表明精子核成熟度對于DNA完整性十分重要。

本研究結果顯示精子核成熟度與正常形態精子百分率呈正相關(P<0.05),與頭部缺陷精子百分率呈負相關(P<0.05),與頸部和中段缺陷、主段缺陷精子百分率無明顯相關性,與Sellami等[19]和Mohammadi等[14]研究結果一致。這可能由于精子頭部主要由細胞核和頂體組成,細胞核凝聚程度決定細胞核的大小,細胞核大小直接影響了頭部的形態,而精子尾部(包括頸部、中段、主段和末段)的形成主要與細胞質脫落和細胞形態演變相關。近來的研究發現占精子頭部面積超過15%的空泡區域富含組蛋白H3和與基因表達相關的表觀遺傳標記H3K4me3,但是缺乏魚精蛋白2和與基因沉默相關的表觀遺傳標記H3K27me3,提示精子頭部缺陷與精子核成熟度低相關[21]。

本研究結果提示精子核成熟度與精子活力(包括PR和IM)相關,但相關性弱。這可能由于染色質高度凝聚使精子頭部體積縮小,有利于精子快速運動[2-3]。但是,精子頭部體積對精子活力的影響是有限的,因為精子尾部結構才是決定精子活力的主要因素[22]。

本研究的優勢:首先,與其他文獻將患者分為精子核成熟度正常組和異常組相比,本研究將患者細分為高成熟組、中成熟組和低成熟組,有助于分析不同水平精子核成熟度患者的精液質量;其次,進一步比較了各組間不同精液參數的異常率,有助于深入探究精子核成熟度對精液質量的實質性影響;再次,本研究中每位患者的精液檢測均使用同一份樣本,盡可能保證了樣本的同質性。但因為本研究為回顧性分析且樣本量有限,研究結論可能存在一定局限性,后續需更大樣本量的臨床研究進一步深入探討,還可以通過基礎研究探討精子核成熟度影響精液質量(尤其是HDS)的分子機制。

綜上所述,精子核成熟度與HDS顯著相關,并且隨著精子核成熟度降低HDS顯著升高,提示在精子核成熟度達到異常值前就要關注HDS的變化。低成熟組的HDS和正常形態精子百分率異常率分別達到61.11%和84.62%,提示臨床上可以根據HDS和正常形態精子百分率判斷是否需要檢查精子核成熟度,以輔助病因查找。此外精子核成熟度與精子活力、精子形態學及DFI相關,但相關性弱,說明精子核成熟度對這些參數的影響有限。本研究結果提示精子核成熟度是反映精子染色質結構的相對獨立因子,可以作為精液常規參數的補充。