D4胚胎發(fā)育速度對體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局的影響

陶林林，鄭波，戴芳芳*，李國臻，耿亞松，楊志偉，戴豪楊，郭鈺英，王樹松

(1.邢臺不孕不育?？漆t(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,邢臺 054000;2.河北省生殖健康科學(xué)技術(shù)研究院 河北省生殖醫(yī)學(xué)重點實驗室,石家莊 050051)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)是目前治療不孕癥最重要的方法之一。盡管在過去的幾十年里,IVF-ET技術(shù)取得了很大進展,但仍有部分患者無法成功妊娠。為了提高臨床妊娠率,在臨床上通常會移植多枚胚胎,這不僅造成胚胎的浪費,而且增加了多胎妊娠率和母嬰并發(fā)癥的發(fā)生率,包括早產(chǎn)、低出生體重兒、新生兒腦癱、學(xué)習(xí)認知障礙及發(fā)育遲緩等[1]。有研究顯示,2011年美國出生的嬰兒中,36%的雙胎及77%的三胎及以上妊娠均來源于輔助生殖技術(shù)(ART)[2]。1次分娩誕生1個健康的嬰兒應(yīng)該是輔助生殖治療的最優(yōu)目標(biāo)[3]。而選擇最具有發(fā)育潛能的胚胎進行移植是ART中提高臨床妊娠率、實現(xiàn)單胚胎移植的關(guān)鍵。

在目前的臨床應(yīng)用中,大部分中心會移植卵裂期胚胎或囊胚,與卵裂期胚胎移植比較,囊胚移植可以更好地進行胚胎選擇、改善子宮內(nèi)膜的同步性,能夠顯著提高種植率,降低流產(chǎn)率[4]。與受精后第3天(D3)卵裂期胚胎及D5囊胚移植相比,D4胚胎移植有一定的優(yōu)勢。眾所周知,自然受孕過程中胚胎在受精后第4日時進入子宮腔,D4胚胎移植更符合生理過程。與D3胚胎比較,D4胚胎已經(jīng)具有激活的胚胎基因組,且在體外受精后第4日,子宮收縮強度降低,子宮內(nèi)膜的容受性提高[5];有研究報道D4胚胎移植的成功率顯著高于D3胚胎[6]。D4胚胎移植比D5胚胎移植縮短了培養(yǎng)時間,可以避免因胚胎體外培養(yǎng)時間的延長導(dǎo)致的基因后天修飾異常[7]。但D5胚胎移植仍然存在因胚胎發(fā)育阻滯或囊胚質(zhì)量差而取消移植的潛在風(fēng)險。Zhang等[8]研究表明D4胚胎移植組的年齡和胚胎情況均優(yōu)于D5胚胎移植組,但兩組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率均無顯著性差異。另有研究報道D4胚胎移植和D5胚胎移植組的種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、足月分娩率及異位妊娠率均無顯著差異[9-10]。Li等[11]的研究結(jié)果表明D4胚胎移植的足月出生率顯著高于D5囊胚。有動物實驗表明,長時間培養(yǎng)的胚胎中,與凋亡、氧化應(yīng)激、縫隙連接形成相關(guān)的印記基因的表達存在差異[12]。也有研究報道D5囊胚移植發(fā)生早產(chǎn)、先天性異常、單卵雙胎、出生體重增加、胎齡較大的風(fēng)險可能更高[7,13-14],但其具體機制尚需要進一步研究。

2011年伊斯坦布爾共識[15]提出了D4胚胎評價的標(biāo)準(zhǔn),為D4胚胎評分提供了參考和依據(jù),但目前尚缺乏選擇D4胚胎統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn),這成為限制D4胚胎移植臨床應(yīng)用的主要因素。本研究比較了不同胚胎移植數(shù)目的3種不同發(fā)育速度(部分融合、完全融合和早期囊胚)的D4胚胎妊娠結(jié)局,以期為D4胚胎移植的選擇提供依據(jù)和參考。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2019年1月至2022年6月期間在邢臺不孕不育?？漆t(yī)院生殖中心行IVF-ET治療的471個周期的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡<40歲;(2)獲卵數(shù)≥5枚;(3)促排卵方案為長效長方案;(4)行IVF-ET治療的患者;(5)在受精后第4日行融合期胚胎或早期囊胚移植;(6)移植胚胎均為正常受精,碎片率均≤20%,無空泡、無多核證據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)存在縱隔子宮、雙子宮等子宮畸形者;(2)使用解凍精子進行受精的患者。本研究符合《赫爾辛基宣言》,且經(jīng)邢臺不孕不育?？漆t(yī)院倫理委員會審批通過[倫理號:(2018)倫審第(09)號]。

根據(jù)移植胚胎發(fā)育速度將D4胚胎移植周期分為3組:部分融合組(移植的胚胎為部分融合胚胎),完全融合組(移植的胚胎為完全融合胚胎)和早期囊胚組(移植的胚胎為早期囊胚);又根據(jù)移植胚胎數(shù)量不同分為單胚胎移植組和雙胚胎移植組。移植胚胎數(shù)量根據(jù)患者自身情況及胚胎質(zhì)量決定,雙胚胎移植組中移植的兩枚胚胎均為部分融合、完全融合胚胎或早期囊胚,排除交叉移植(如1枚部分融合胚胎+1枚完全融合胚胎)的周期。分別比較單胚胎移植和雙胚胎移植患者不同D4胚胎發(fā)育速度亞組的妊娠結(jié)局。

二、診療回顧

1.卵母細胞獲取及受精:應(yīng)用長效長方案促排卵,雙側(cè)卵泡至少2枚直徑達18～20 mm以上時,于當(dāng)晚肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG,珠海麗珠制藥)5 000～10 000 U,注射后36.5 h左右行陰道超聲引導(dǎo)下取卵,獲得卵丘卵母細胞后,洗滌兩遍,立即置入三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取卵當(dāng)日經(jīng)手淫法獲得精液,經(jīng)過優(yōu)化處理后于取卵后3～4 h進行IVF受精,調(diào)整精子受精密度為20 000個/卵母細胞,受精后4～6 h拆除卵母細胞周圍顆粒細胞,繼續(xù)置于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有胚胎培養(yǎng)均使用瑞典Vitrolife G5系列培養(yǎng)液。

2.胚胎培養(yǎng)及移植:受精后16～18 h觀察受精情況,記錄原核(PN)數(shù)目,2PN為正常受精;受精后第2日和第3日評估卵裂期胚胎質(zhì)量,記錄胚胎細胞數(shù)、碎片比例、細胞大小是否均勻,第2日若發(fā)現(xiàn)有細胞多核、空泡等則進行記錄。取卵當(dāng)日即肌肉注射黃體酮注射液(浙江仙琚制藥)進行黃體支持。根據(jù)HCG注射日雌二醇(E2)水平,移植日給予適量E2(補佳樂,拜耳醫(yī)藥,德國)補充,移植當(dāng)日常規(guī)使用黃體酮(安琪坦,博賞醫(yī)藥,法國)80 mg口服或陰道給藥進行黃體支持。

3.妊娠結(jié)局判斷:移植后14 d查血β-HCG確定HCG陽性(HCG≥10 U/L),移植后28 d陰道超聲檢查見孕囊者定義為臨床妊娠;孕12周內(nèi)妊娠丟失定義為早期流產(chǎn)。

4.胚胎形態(tài)學(xué)評分:在受精后第3日,根據(jù)每個胚胎的卵裂球數(shù)目、大小和碎片等情況進行形態(tài)學(xué)評分。其中細胞數(shù)≥6,卵裂球大小均一或略微不均一,形態(tài)規(guī)則或欠規(guī)則,碎片率≤50%的胚胎為可用胚胎。

在受精后第4日[受精后(94±1)h],結(jié)合伊斯坦布爾共識[15]對D4胚胎質(zhì)量進行評估記錄,標(biāo)準(zhǔn)如下:卵裂期胚胎(記錄細胞數(shù)):卵裂球之間沒有融合跡象;部分融合胚胎(記錄卵裂球融合比例):卵裂球之間出現(xiàn)融合跡象,部分細胞之間的胞膜界限不清晰,細胞融合比例0%～99%;完全融合胚:所有卵裂球均融合到一起,各細胞胞膜界限不清晰,胚胎形態(tài)像一個大細胞;早期囊胚:細胞數(shù)量明顯增多,各細胞之間的界限再次顯現(xiàn),部分細胞呈月牙形、梭形,且細胞間出現(xiàn)腔隙,形成早期囊胚。均記錄碎片比例及空泡。本中心根據(jù)獲得的D4胚胎質(zhì)量及患者身體狀況選擇1～2枚最優(yōu)的胚胎移植,伊斯坦布爾共識[15]中提出,發(fā)育到完全融合及以上胚胎為質(zhì)量較好的胚胎,因此在有完全融合及早期囊胚的情況下,大部分患者會采用單胚胎移植。

5.觀察指標(biāo):D3可用胚率=D3可用胚數(shù)/卵裂數(shù)×100%;臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%;種植率=種植胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%;多胎率=胎囊數(shù)≥2個的周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%;早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%;晚期流產(chǎn)率=晚期流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者基本資料比較

不同胚胎移植數(shù)目的不同發(fā)育速度亞組間患者年齡、不孕年限、不孕類型、基礎(chǔ)性激素水平、HCG注射日激素水平及不孕因素占比等均無顯著性差異(P>0.05),詳見表1。

表1 各組基礎(chǔ)資料比較[(-±s),M(P25,P75),n(%)]

二、各組患者獲卵數(shù)、胚胎發(fā)育情況及移植日子宮內(nèi)膜厚度比較

不同胚胎移植數(shù)目的不同發(fā)育速度亞組間比較結(jié)果顯示,單胚胎移植組中,早期囊胚組的獲卵數(shù)顯著高于部分融合組(P<0.05),D3可用胚胎率顯著高于完全融合組(P<0.05);雙胚胎移植組中,早期囊胚組的D3可用胚胎率顯著高于部分融合組和完全融合組(P<0.05)。單胚胎移植或雙胚胎移植組中,2PN受精率、2PN卵裂率和移植日內(nèi)膜厚度在不同亞組間均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組患者獲卵數(shù)、胚胎發(fā)育情況及移植日子宮內(nèi)膜厚度比較[(-±s),%]

三、各組患者妊娠結(jié)局比較

單胚胎移植或雙胚胎移植組中,隨著移植胚胎級別逐漸成熟(從部分融合到早期囊胚),不同亞組間臨床妊娠率和種植率逐漸增高。雙胚胎移植組中,早期囊胚組的臨床妊娠率顯著高于部分融合組和完全融合組(P<0.05),種植率顯著高于部分融合組(P<0.05);完全融合組及早期囊胚組的多胎率有高于部分融合組的趨勢,但尚無顯著性差異(P>0.05);3亞組間的早期流產(chǎn)率和晚期流產(chǎn)率均無顯著性差異(P>0.05)。單胚胎移植組中,部分融合組臨床妊娠率較低,僅為45.45%;雙胚胎移植組中,部分融合組和完全融合組的臨床妊娠率無顯著性差異(P>0.05),但均顯著高于單胚胎移植組中的完全融合組(P<0.05)(表3)。

表3 各組患者妊娠結(jié)局比較(%)

四、影響D4胚胎移植臨床妊娠相關(guān)因素的Logistic回歸分析

Logistic回歸分析的結(jié)果顯示,校正相關(guān)混雜因素(年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、基礎(chǔ)LH、AMH及HCG日E2、LH及P、內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、移植胚胎數(shù))后,早期囊胚移植的臨床妊娠率顯著高于完全融合與部分融合胚胎移植,提示D4胚胎級別對臨床妊娠有顯著影響(P<0.05)(表4)。

表4 影響臨床妊娠相關(guān)因素的二元logistic回歸分析

討 論

Fabozzi等[16]通過觀察桑椹胚的融合和碎片情況對胚胎進行評分,檢驗桑椹胚形態(tài)是否能夠預(yù)測囊胚形成和囊胚質(zhì)量,結(jié)果表明桑椹胚評分的預(yù)測能力要優(yōu)于傳統(tǒng)D3胚胎評分。有研究提出了一種基于胚胎融合比例和D4與D3胚胎卵裂球數(shù)比值的新分級系統(tǒng);這項研究表明,新分級系統(tǒng)可成為通過胚胎形態(tài)學(xué)輔助D4胚胎選擇的有用工具[17]。上述文獻中的D4胚胎分級均涉及到卵裂球的融合度,這是決定D4胚胎多細胞融合團形成的關(guān)鍵因素。只有部分融合的胚胎評分較低,往往預(yù)示著較差的臨床結(jié)局[18];但目前尚未形成統(tǒng)一的D4胚胎評價標(biāo)準(zhǔn)。

本中心在評價D4胚胎時綜合考量了細胞融合度、碎片比例、有無多核和空泡等方面,選擇較優(yōu)質(zhì)的胚胎進行移植,并比較了D4不同發(fā)育速度胚胎的妊娠結(jié)局,由于D4卵裂期胚胎移植較少(僅6個周期),臨床妊娠率較低,僅33.33%(2/6),且常規(guī)不進行該類胚胎移植,故此6個周期的數(shù)據(jù)未納入分析。本研究結(jié)果顯示,單胚胎移植組中,早期囊胚組的獲卵數(shù)顯著高于部分融合組,D3可用胚胎率顯著高于完全融合組(P均<0.05);雙胚胎移植組中,早期囊胚組的D3可用胚胎率顯著高于部分融合組和完全融合組(P<0.05),提示D4有早期囊胚形成的患者胚胎質(zhì)量較好。從部分融合到早期囊胚,單胚胎移植組和雙胚胎移植組的臨床妊娠率和種植率均逐漸增高;Logistic回歸分析顯示,早期囊胚組的臨床妊娠率顯著高于完全融合組與部分融合組,提示D4胚胎發(fā)育速度對臨床妊娠有顯著影響(P<0.05)。因此,在臨床工作中,D4移植時可以優(yōu)選早期囊胚,其次是完全融合胚。陳映雪等[19]的報道與本研究結(jié)果相似,完全融合及早期囊胚臨床妊娠率顯著高于部分融合胚(P<0.05),且能獲得與良好囊胚移植相似的臨床妊娠率。Zhang等[8]研究也表明D4移植完全融合胚和早期囊胚能夠獲得較高的臨床妊娠率和活產(chǎn)率。提示選擇D4完全融合及以上級別的胚胎進行單胚胎移植能夠獲得滿意的妊娠結(jié)局,同時降低多胎率。早期囊胚及完全融合的D4胚胎具有較高的種植率,表明早期達到完全融合及出現(xiàn)囊腔的D4胚胎具有較高的著床潛力。有研究報告稱,與非妊娠組相比,妊娠組桑椹胚致密化的時間及囊胚形成的時間明顯更早[20]。Campbell等[21]報道,整倍體胚胎達到致密化階段的時間明顯比非整倍體胚胎更短,表明早期達到完全融合階段的D4胚胎可能具有較高的整倍性。在基因轉(zhuǎn)錄譜中,胚胎致密化伴隨著從母體基因組到合子基因組的轉(zhuǎn)變。這些功能變化將導(dǎo)致細胞分化為內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層,對于囊胚形成至關(guān)重要[22]。據(jù)報道,胚胎融合延遲發(fā)生會導(dǎo)致囊胚內(nèi)細胞團變小[23]。這一發(fā)現(xiàn)表明,延遲致密化會影響胚胎質(zhì)量。因此,D4選擇生長較快的胚胎進行移植,可以避免移植質(zhì)量較差的胚胎。融合過程延遲胚胎生長緩慢的原因可能是胚胎本身或者體外環(huán)境不太理想,對細胞周期產(chǎn)生負面影響,導(dǎo)致胚胎發(fā)育速度較慢。Hsieh等[24]研究表明在D4發(fā)育為早期囊胚的D5囊胚有較高的臨床妊娠率、種植率和持續(xù)種植率,且與D4完全融合胚比較,D4早期囊胚有較高的潛力發(fā)育為優(yōu)質(zhì)囊胚,因此D4早期囊胚的出現(xiàn)可以作為選擇高質(zhì)量胚胎的有效標(biāo)準(zhǔn)之一,也可作為改善妊娠結(jié)局的預(yù)測因子。同時,發(fā)育較快的胚胎與子宮內(nèi)膜具有更好的同步性[18],這是發(fā)育較快胚胎有較好的妊娠結(jié)局的重要影響因素。

本研究結(jié)果顯示移植1枚和移植兩枚完全融合胚及早期囊胚的臨床妊娠率和種植率均較高,但移植2枚胚胎時多胎率較高,甚至達到了50%以上,因此建議D4胚胎達到完全融合及早期囊胚時選擇單胚胎移植以降低多胎率。移植1枚胚胎時,部分融合組臨床妊娠率較低;移植兩枚部分融合胚的臨床妊娠率與移植兩枚完全融合胚無顯著性差異(P>0.05),且顯著高于移植1枚完全融合胚(P<0.05),因此對于D4無完全融合及以上級別胚胎形成的周期,建議移植兩枚部分融合胚以提高臨床妊娠率。但本研究為單中心的回顧性分析,可能存在取樣偏性,其結(jié)論尚待進一步擴大樣本量及開展隨機對照試驗進一步證實。由于本中心對于部分融合胚大部分周期會移植兩枚,因此移植1枚部分融合胚入組周期數(shù)較少,研究結(jié)果可能存在一定的偏倚。對于D4胚胎評價標(biāo)準(zhǔn),本研究僅對胚胎發(fā)育速度進行了分析,今后將會在胚胎發(fā)育動力學(xué)及代謝組學(xué)等方面展開研究,以增加客觀指標(biāo)對D4胚胎進行評價,建立D4胚胎評價體系,挑選更高發(fā)育潛能的胚胎移植,提高妊娠結(jié)局。

綜上所述,IVF-ET過程中,隨著D4胚胎發(fā)育速度增快,臨床妊娠率和種植率逐漸增高;D4胚胎移植應(yīng)優(yōu)選早期囊胚移植,其次是完全融合胚,且D4發(fā)育到完全融合及以上級別的胚胎建議行單胚胎移植以降低多胎率,對部分融合胚則建議移植兩枚。