FSHR基因多態性在顆粒細胞中的表達與卵巢儲備功能及妊娠結局的相關研究

李淑芳，劉芳，趙杰，薛聿婷，席靜，付文慧

(1.內蒙古醫科大學,呼和浩特 010050;2.內蒙古醫科大學附屬醫院生殖醫學中心,呼和浩特 010050)

近年來因卵巢儲備功能異常行輔助生殖技術(ART)助孕的比例呈現上升趨勢[1]。卵巢儲備功能影響因素十分復雜,包括年齡、遺傳因素、環境危害、盆腔手術、免疫因素等。有研究報道,一些單核苷酸多態性(SNP)位點變異可能與卵巢儲備差異相關,在輔助生殖過程中應該考慮這些SNP位點變異對于卵巢功能的影響[2]。為此本研究選擇FSHR-rs6166基因探究基因多態性在顆粒細胞中的表達以及與卵巢儲備功能、妊娠結局及卵巢反應性的相關性。

資料與方法

一、研究對象

選取2020年9月至2022年10月就診于內蒙古醫科大學附屬醫院生殖醫學中心實施ART助孕治療的不孕癥患者為研究對象。

納入標準:(1)20～40歲女性;(2)染色體及核型正常;(3)無盆腔手術史;(4)近3月未使用任何激素類藥物;(5)既往無盆腹腔放化療病史;(6)無其他內分泌疾病。

排除標準:(1)未能按計劃進入周期;(2)男方精子檢測異常者;(3)供精供卵助孕者;(4)胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)助孕。

本研究共納入103例患者,研究設計經內蒙古醫科大學附屬醫院倫理委員會批準(倫審號:2017醫012),所有研究對象均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COH):所有入組者進入ART周期,采用常規黃體期短效長方案進行COH。選用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)短效制劑(達菲林,輝凌,德國) 0.1 mg/d,降調節達標準后啟動促性腺激素(Gn),B超監測卵泡發育狀況對Gn量進行調整,在卵泡成熟后停用Gn,肌肉注射人絨毛膜促性腺激素(HCG,珠海麗珠)8 000～10 000 U,36 h后在B超引導下經陰道穿刺取卵。IVF受精,胚胎培養3 d,選取評分Ⅰ-Ⅱ級胚胎移植2枚。

2.顆粒細胞的提取:在凈化后的操作臺內將剩余卵泡液放入離心管中,2 300 r/min離心15 min,去掉上清液,加入3～5倍細胞體積的紅細胞裂解液,輕輕吹打混勻,裂解1～2 min,以2 300 r/min再離心5 min,去掉紅色上清液;若沉淀仍有肉眼可見紅色,重復裂解一次,加入5～8倍細胞體積的PBS緩沖液并清洗細胞,2 300 r/min離心5 min,棄掉上清液,加入適量細胞凍存液,轉入-80℃冰箱中冷凍保存。

3.熒光定量PCR檢測FSHR-rs6166:將凍存的顆粒細胞解凍后,用Trizol法提取顆粒細胞總RNA,紫外分光光度計檢測RNA濃度,進行反轉錄、熒光定量PCR擴增。引物序列為如下:FSHR-rs6166 Forword 引物序列5’到3’TTTGTGGTCATCTGTGGCTGC,Reverse引物序列5’到3’ CAAAGGCAAGGACTGAATTATCATT。反應體系如下:模板2 μl,引物1(10 μmol/L) 2 μl,引物2(10 μmol/L) 2 μl,2×反應混合物25 μl,雙蒸水50 μl。反應條件為:94℃預變性3 min,94℃30 s,55℃30 s,72℃45 s,共30個循環,終末72℃延伸5 min。

4.瓊脂凝膠電泳檢測、回收及測序:PCR反應結束后,使用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物,觀察顯影結果并照相。將PCP所得擴增產物行膠回收,將膠回收純化的PCR產物送至上海生工生物工程股份有限公司進行一代測序。將測序結果利用SnapeGene軟件與原序列進行比對分析,確定是否突變,并統計基因型。

三、數據采集及判斷標準

1.患者基本資料收集:年齡、不孕年限、體質量指數(BMI)、基礎卵泡刺激素(bFSH);患者進入周期后該周期內Gn啟動劑量、Gn天數、Gn總量、HCG日E2水平、HCG日內膜厚度、獲卵數、卵巢反應性、MⅡ卵數、2PN數、受精卵數、卵裂數、可移植胚胎數、優質胚胎數、移植周期數、妊娠結局。

2.臨床妊娠判定標準:胚胎移植后14 d行血清β-HCG檢測,陽性者(HCG≥5 U/L)于移植后28 d行陰道超聲檢查示妊娠囊及心管搏動者,確定為臨床妊娠。

3.卵巢反應性[3]:獲卵數≤4枚者為卵巢低反應;獲卵數為5～14枚者為卵巢正常反應;獲卵數為≥15枚者為卵巢高反應。

四、統計學分析

結 果

一、PCR瓊脂凝膠電泳、測序結果

PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠圖顯示,FSHR-rs6166 SNP基因型所對應的條帶長度在108～521 bp之間,有三種類型(表1和圖1)。擴增產物回收純化測序,基因型分別為AA、AG和GG(圖2)。

圖1 FSHR-rs6166 PCR擴增產物電泳圖

圖2 FSHR-rs6166 PCR擴增產物基因測序結果

表1 FSHR-rs6166 SNP基因型條帶情況

二、FSHR-rs6166基因多態性分布

研究103例行ART女性的FSHR-rs6166基因型與等位基因情況,其分布情況如表2所示。運用Haploview軟件對位點FSHR基因的SNP位點進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。兩個位點的基因型在研究對象中的分布(χ2=0.897,P=0.344)符合Hardy-Weinberg平衡定律,達到了遺傳平衡,具有群體代表性。

表2 FSHR-rs6166 SNP位點的基因型及等位基因頻率分布[n(%)]

三、3組FSHR-rs6166基因型患者的一般資料

FSHR-rs6166位點上3組基因型患者間的年齡、BMI、不孕年限差異均無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 三組FSHR-rs6166基因型患者間的一般資料比較(-±s)

四、FSHR-rs6166不同基因型患者間的卵巢儲備功能

GG組及AG組的bFSH值顯著高于AA組(P=0.003),AA組的AMH顯著高于GG組及AG組(P=0.036);3組基因型患者間的AFC差異雖然無統計學意義(P>0.05),但在數值上GG組的AFC低于AG組及AA組(表4)。

表4 三組FSHR-rs6166 基因型間卵巢儲備功能指標比較(-±s)

五、3組FSHR-rs6166基因型患者的臨床及實驗室指標

3組患者的Gn啟動量、Gn總量、Gn天數、HCG日E2、獲卵數、MⅡ卵數、2PN數、卵裂數差異均無統計學意義(P>0.05),但GG組的Gn總量、Gn天數高于AG組及AA組,且GG組的HCG日E2水平、獲卵數MⅡ卵數、2PN數、卵裂數低于AG組及AA組(表5、表6)。

表5 三組FSHR-rs6166基因型患者間的臨床指標比較(-±s)

表6 三組FSHR-rs6166基因型患者間的實驗室指標比較(-±s)

六、3組FSHR-rs6166基因型患者的ART結局

統計結果顯示,3組患者間的受精率、優質胚胎率、臨床妊娠率、活產率差異均無統計學意義(P>0.05)(表7)。

表7 FSHR-rs6166 3組基因型間ART結局相關指標比較(%)

七、3組FSHR-rs6166基因型患者的卵巢反應性

3組患者促排卵后出現卵巢高反應、正常反應及低反應的比例差異無統計學意義(P>0.05)(表8)。

表8 FSHR-rs6166 3組基因型患者卵巢反應性比較[(n)%]

討 論

FSH由垂體分泌,通過與卵巢顆粒細胞上的FSHR結合促進卵泡顆粒細胞增殖分化,從而促進卵泡發育與成熟,所以FSHR基因的穩定性決定了FSH的功能。FSHR基因包含10個外顯子和9個內含子,大多數研究集中在FSHR的單核苷酸多態性在第10外顯子的替換上。該基因細胞內域的680位密碼子堿基G代替A,會有三種基因型:野生型AA基因型、突變型GG基因型、雜合子型AG基因型。本研究選入的103例ART助孕女性中,FSHR-rs6166 野生型AA基因型是最常見的基因型,頻率為49.5%,這與國內李路等[4]的研究結果相似。國外學者的相關研究示,AG基因型是荷蘭、日本人群中最常見的基因型[5-6],這說明FSHR多態性的分布差異可能與地域有關。

一、FSHR-rs6166基因多態性對卵巢儲備功能的影響

卵巢儲備功能即卵巢內的卵泡生長、發育、形成可受精卵母細胞的能力,包括卵巢內存留的卵泡數量及質量兩方面[7]。目前,在ART助孕過程中,主要通過FSH、AMH、AFC等評估卵巢儲備功能及預測獲卵數。近年來研究顯示:FSHR的基因突變影響女性的生育力[8]。Aittomaki等[9]最早提出卵巢儲備功能與FSHR受體的突變相關,顏元良等[10]進一步證實FSHR-rs6166位點突變型GG基因型可能與女性卵巢儲備功能下降相關。本研究中,FSHR-rs6166 GG組患者的bFSH值顯著高于AA組(P<0.05),GG組的AMH顯著低于AA組(P<0.05);雖然3組患者的 AFC差異無統計學意義,但在數值上GG組的AFC低于AA組。結果提示FSHR-rs6166 突變型GG基因型患者的卵巢儲備功能較AA基因型低下。分析FSHR基因突變影響其功能的原因主要包含以下3個方面:(1)突變體所表達的FSHR并未大量正常表達于細胞膜上而是聚集于細胞質內部,降低FSHR轉運至細胞表面的能力,影響與配體FSH的結合力;(2)抑制腺苷酸環化酶的活性,影響第二信使cAMP產生,從而抑制信號轉導;(3)突變使編碼FSHR的氨基酸發生改變,阻礙FSHR的翻譯過程,FSHR蛋白生成減少,可能使顆粒細胞對FSH反應不良[11]。

二、FSHR-rs6166基因多態性對卵巢反應性的影響

在COH過程中,卵巢對外源性Gn的反應直接影響到Gn用量、HCG日E2水平、獲得卵母細胞的數量及質量。目前,FSHR基因多態性與卵巢反應性的關聯被人們關注[12],但國內外對FSHR-rs616基因多態性對卵巢反應性的研究結果不完全相同。一些研究[13-15]表明GG基因型的患者易發生卵巢低反應,而Mohiyiddeen等[16]表明FSHR-rs6166基因型與卵巢反應性無關。本研究中,3組基因型患者發生卵巢高、正常及低反應的差異無統計學意義(P>0.05)。雖然3組基因型Gn啟動量、Gn總量、Gn天數、HCG日E2水平差異無統計學意義(P>0.05),但在數值上GG組的Gn總量、Gn天數高于AG組及AA組,且GG組的HCG日E2水平、獲卵數低于AG組及AA組。這可能是因為突變型GG基因型的患者卵巢儲備功能降低,所以在COH過程中會因卵泡生長緩慢或卵泡數量少而增加Gn總量和延長給藥時間,同時獲卵數及HCG日E2水平也低于AG組及AA組。因此,對于卵巢儲備功能低下高危人群,根據基因位點的檢測結果,在未發生卵巢儲備功能降低前適當提早進入ART周期,或在進入ART周期后選擇個體化的促排卵方案以縮短Gn使用時間及降低Gn用量,這樣不僅能讓患者盡早妊娠而且減少了患者心理負擔及經濟負擔。

三、FSHR-rs6166基因多態性對ART結局的影響

現有研究對FSHR-rs6166基因多態性對ART結局的影響也不一致:Jun等[17]研究結果發現,GG基因型的受精率、胚胎移植率及臨床妊娠率高于AA及AG基因型;Mohammad等[18]研究表明AA基因型的臨床妊娠率高于AG及GG基因型;而Dimitris等[19]研究結果顯示,3組基因型臨床妊娠率無差異;K?nig等[20]研究指出,3組基因型與活產率無關。本研究中,FSHR-rs6166不同基因型在MⅡ卵數、2PN數、卵裂數、受精率、優質胚胎率、臨床妊娠率、活產率差異無統計學意義(P>0.05),這與Dimitris等[19]、馬卓群等[15]的研究一致,原因可能是ART助孕過程中妊娠結局由眾多因素所決定,包括年齡、卵巢儲備功能、子宮內膜的容受性、胚胎的質量及環境因素等決定,而非單一因素決定。

綜上所述,FSHR-rs6166基因的多態性與卵巢儲備功能相關,突變型GG基因型患者卵巢儲備功能相對低下,因此在進行ART前對FSHR基因多態性進行檢測,依據不同的基因型制定個體化促排卵方案,減少患者及其家庭精神與經濟負擔,對臨床工作有一定意義。但基因多態性對妊娠結局、能否預測卵巢反應性的影響并不明顯,還需要通過大樣本的實驗進一步研究。