卵泡液中sRAGE、Vit D和TNF-α的含量與卵母細胞質量的相關性研究

許嘉綿，毛麗華，林春麗，熊萍，黃吳鍵，劉蕓*

(1.福建醫科大學?？偱R床醫學院,福州 350025;2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○○醫院生殖醫學中心,福州 350025)

由始基卵泡發育為成熟卵泡的過程中,卵泡受體內外多種因素影響。體外因素如環境、飲食、精神狀態等,體內因素包括下丘腦-垂體-卵巢軸的作用、卵冠丘復合物的旁分泌因子作用以及由顆粒細胞、卵泡膜細胞分泌的代謝物組成的卵泡液的影響等[1-3]。卵母細胞質量對胚胎發育潛能起重要作用,從而進一步影響胚胎種植和臨床妊娠率。在輔助生殖助孕過程中,胚胎形態學評估是目前篩選可移植胚胎的主要方法,但其有效性仍然不足,如能在卵母細胞階段對其質量進行評估,將增加胚胎篩選指標,提高對胚胎著床能力判斷的準確性。卵泡液(FF)代表著卵母細胞及顆粒細胞生長的環境,可能對卵母細胞質量產生影響[4]。在人體內,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和可溶性晚期糖基化終產物受體(sRAGE)主要介導炎癥反應和氧化應激的發生,維生素D(Vit D)主要參與機體鈣磷代謝的穩態調節,研究發現這些物質都參與到女性生殖系統的功能調節活動中,且能在卵泡液內被檢測到,可能對卵母細胞發育有調節作用[5-7]。本研究通過檢測單個卵母細胞FF中sRAGE、Vit D和TNF-α的含量,探討其與卵母細胞及胚胎質量的關系,為臨床不孕患者的診療提供新思路。

資料和方法

一、研究對象

選擇2021年6月至2022年8月于聯勤保障部隊第九○○醫院生殖中心行IVF-ET治療的不孕女性(12例)的81個卵母細胞的FF樣本。該研究符合赫爾辛基宣言。該研究已通過醫院倫理委員會審查,所有研究對象均簽署知情同意書。納入標準:輸卵管因素不孕患者且年齡<38歲,基礎竇卵泡數5～15個、獲卵數3～15個,基礎促卵泡素≤12 U/L、體質量指數(BMI)為17～25 kg/m2。排除標準:多囊卵巢綜合征(PCOS);合并卵巢手術史、子宮畸形、子宮內膜異位癥、卵巢早衰等生殖系統疾病;合并內分泌、慢性代謝性疾病;遺傳性疾病史;男方畸形精子癥、逆行射精癥、阻塞性無精子癥等。

二、研究方法

1.促排卵方案:所有患者均接受拮抗劑靈活方案進行控制性促排卵(COH),促性腺激素(Gn)使用注射用重組人促卵泡激素(果納芬,默克,意大利),用量根據患者年齡、BMI及內分泌激素水平進行調整。當至少有1/3的主導卵泡直徑≥18 mm時注射絨毛膜促性腺激素(HCG,艾澤,默克,意大利)進行扳機。

2.樣本收集與測定:HCG扳機后36～38 h,在陰道超聲引導下經陰道后穹隆穿刺取卵,收集卵母細胞用于IVF后剩余單個卵泡液放置于單獨的試管內,避免沖洗液和血液污染卵泡內容物,2 000 r/min離心10 min,取上清液置于-80℃冰箱避光保存待測。

3.二維超聲測量卵泡直徑:選取該卵泡的最大切面,量取最大長徑和其垂直平分線長度橫徑,取兩者平均值并記錄。

4.FF體積測量:胚胎實驗室的工作人員在顯微鏡下收集卵母細胞后,將剩余FF倒入5 ml帶刻度的無菌離心管中,根據刻度進行測定。

5.卵泡液中sRAGE、Vit D、TNF-α含量測定:均采用ELISA(上海酶聯生物)法,檢測步驟為:樣本孔中加入50 μl待測樣本及檢測抗體,用封板膜封住反應孔,60 min后將孔中溶液甩凈,使用緩沖液進行浸洗,烘干殘液,重復洗滌5次;接著加入底物TMB,15 min后加入終止溶液;最后用酶標儀(SPECTRO Star,德國)在450 nm波長依次測量測量各孔的光密度(OD值),計算樣本濃度。

6.卵母細胞及胚胎質量評估與分組:81個卵泡中有72個成熟卵母細胞(MⅡ),將其歸為成熟卵母細胞組,其余9個歸為未成熟卵母細胞組(GV和MI)[8]。胚胎體外培養3 d后,按Peter卵裂期評分系統對胚胎進行評估[9],其中Ⅰ級:卵裂球大小均勻,形狀規則,透明帶完整,胞質均勻無顆粒現象,碎片<10%;Ⅱ級:卵裂球大小稍不均勻,形狀稍不規則,胞質有顆?，F象,碎片<20%;共有61個卵母細胞發育到6～10個卵裂球的Ⅰ、Ⅱ級胚胎[5],將其歸于優質胚胎組(n=61),其余為非優質胚胎組(n=20)。有20個胚胎進行新鮮胚胎移植,剩余61個胚胎在體外繼續培養至第5～6天,最終形成34個囊胚,按Gardner囊胚期評分系統對囊胚進行評估[10],先根據囊胚的擴張和孵出程度將囊胚分成1～6級,對于3-6級囊胚再根據內細胞團(ICM)和滋養外胚層(TE)細胞進行評分;其中有26個胚胎發育至3期及3期以上、ICM及TE細胞均為B級及以上的囊胚,將其歸為優質囊胚組(n=26),其余為非優質囊胚組(n=8)。

三、統計學分析

結 果

一、各組卵泡形態和FF中sRAGE、Vit D和TNF-α含量水平檢測結果

1.按卵母細胞成熟度分組比較:結果顯示,成熟卵母細胞組的卵泡直徑、FF體積、FF中sRAGE和Vit D含量顯著高于不成熟卵母細胞組(P均<0.05);成熟卵母細胞組的TNF-α水平顯著低于不成熟卵母細胞組,差異具有顯著性(P<0.05)(表1)。

表1 成熟卵母細胞組與不成熟卵母細胞組間各指標的比較(-±s)

2.按胚胎發育評分分組比較:結果顯示,優質胚胎組FF中sRAGE、Vit D含量顯著高于非優質胚胎組(P均<0.05),優質胚胎組的TNF-α含量顯著低于非優質胚胎組(P<0.05);優質胚胎組卵泡直徑、FF體積與非優質胚胎組差異不無統計學意義(P均>0.05)(表2)。

表2 優質胚胎組與非優質胚胎組間各指標的比較(-±s)

3.按囊胚發育情況分組比較:結果顯示,優質囊胚組FF中sRAGE、Vit D含量顯著高于非優質囊胚組(P均<0.05),優質囊胚組TNF-α含量顯著低于非優質囊胚組(P<0.05);優質囊胚組卵泡直徑、FF體積與非優質囊胚組差異不具有顯著性(P均>0.05)(表3)。

表3 優質囊胚組與非優質囊胚組間各指標的比較(-±s)

二、FF中sRAGE、Vit D和TNF-α水平的相關分析

FF中sRAGE水平與卵母細胞成熟度、胚胎發育情況、囊胚發育情況等指標均有正相關關系(r分別為0.247、0.257、0.385,P均<0.05);FF中Vit D水平與卵母細胞成熟度、胚胎發育情況等指標均呈正相關性(r分別為0.242、0.241,P均<0.05),而與囊胚發育情況呈正相關,但無統計學意義(r為0.299,P>0.05);FF中TNF-α水平與卵母細胞成熟度、胚胎發育情況、囊胚發育情況等指標均有負相關關系(r分別為-0.311、-0.234、-0.417;P均<0.05)(表4、5、6)。

表4 卵泡液sRAGE水平與臨床指標相關性

表5 卵泡液維生素D水平與臨床指標相關性

表6 卵泡液TNF-α水平與臨床指標相關性

FF中sRAGE與Vit D水平顯著正相關(r=0.434,P<0.001);FF中sRAGE、Vit D水平與TNF-α水平顯著負相關(r分別為-0.623、-0.578,P<0.001)(圖1、2、3)。

圖1 卵泡液中sRAGE水平與維生素D水平的相關性

圖2 卵泡液中sRAGE水平與TNF-α水平的相關性

圖3 卵泡液中維生素D水平與TNF-α水平的相關性

討 論

在輔助生殖助孕過程中,形態學評估是篩選可移植胚胎的主要方法,但其存在著某些局限性,如胚胎學者的主觀性、靜態的胚胎形態學觀察、多次將胚胎從培養箱取出觀察會改變培養環境等,故形態看起來正常的胚胎可能并不正常[11-12]。因此,如果能夠在卵母細胞階段對其質量進行評估,將增加胚胎篩選指標,提高對胚胎著床能力判斷的準確性。卵泡液(FF)中含顆粒細胞、卵泡膜細胞分泌的代謝物以及血漿通過血液卵泡屏障濾過的小分子物質,其代表著卵母細胞及顆粒細胞生長的環境,已有多項研究發現FF中的某些物質可以反映卵母細胞質量、受精能力及隨后的胚胎發育潛能[3-4,13]。

sRAGE可通過結合循環的AGEs競爭性抑制AGE-RAGE相互作用和下游促炎癥信號,保護細胞組織等免受RAGE-AGEs系統所介導的損傷反應[14]。Takahashi等[5]研究發現,胚胎形態發育良好的卵母細胞卵泡液中的AGE/sRAGE、IL-6和IL-8水平和卵泡顆粒細胞中轉錄因子4(ATF4)、IL-6和IL-8的mRNA表達顯著低于胚胎形態發育不良的卵母細胞;在小干擾RNA(siRNA)耗盡ATF4后,使用牛血清白蛋白(BSA)處理培養的人顆粒細胞,顆粒細胞中IL-6和IL-8的mRNA表達效應減弱。提示AGEs在卵泡中的積累可通過激活卵泡微環境中的ATF4觸發炎癥,從而降低卵母細胞發育能力。Wang等[15]通過往顆粒細胞培養皿中加入不同水平的sRAGE,研究發現sRAGE在顆粒細胞中通過調節P-ERK和AP-1信號傳導減輕了炎癥反應。腫瘤壞死因子-α是由單核細胞及巨噬細胞等產生的炎癥細胞因子[16]。研究發現TNF-α可以影響卵巢功能、胚胎的附著、滋養層的發育和胎盤細胞增殖等,在女性生殖健康中扮演著重要角色[17-18]。

本研究觀察到,卵泡液中sRAGE水平在成熟卵母細胞組、優質胚胎組、優質囊胚組中顯著升高(P均<0.05),且與各指標均呈正相關關系(r分別為0.247、0.257、0.385;P均<0.05);而TNF-α水平在成熟卵母細胞組、優質胚胎組、優質囊胚組中顯著降低(P均<0.05),且與各指標均呈負相關關系(P均<0.05);同時FF中sRAGE水平與TNF-α水平明顯負相關(r為-0.623;P<0.001)。本研究與之前大多數學者們的研究結果相一致,炎癥效應會影響卵母細胞及胚胎的發育,而sRAGE作為保護因子,對卵母細胞及胚胎發育具有一定的有利作用,但其具體的調節機制還有待進一步研究。

一項橫斷面觀察研究發現Vit D與囊胚的發育有密切關系,人體內足夠的Vit D可增加獲得更多數目及更高質量囊胚的概率[19]。Chen 等[20]對377例不孕患者進行病例對照研究發現,血清Vit D水平與白細胞介素6(IL-6)水平呈顯著負相關,而Vit D缺乏和高水平IL-6是輸卵管性不孕的危險因素,考慮Vit D可能通過抑制IL-6的產生來降低不孕癥的風險。進一步研究發現,Vit D能夠通過MAPK/NF-κB、ERK信號通路下調TNF-α的表達[21-23]。此外,研究發現補充外源性Vit D可以增加FF中的sRAGE水平[24-25],Vit D對RAGE的抑制或刺激作用由各種信號通路介導,包括MAPK/NF-κB、ADAM10/MMP9等[26-27]。

本研究觀察到,FF中Vit D水平在成熟卵母細胞組、優質胚胎組、優質囊胚組中顯著升高(P均<0.05),且與成熟卵母細胞、優質胚胎呈正相關關系(r分別為0.242、0.241;P均<0.05);FF中Vit D與TNF-α水平明顯負相關(r為-0.578;P<0.001),與sRAGE水平明顯正相關(r為0.434;P<0.001)。本研究與之前大多數學者們的研究結果相一致,Vit D與卵母細胞發育密切相關。此外,本研究發現sRAGE與Vit D、TNF-α之間關系密切,對于行IVF助孕治療的不孕患者,可能通過補充AGEs抑制劑、Vit D等外源性物質來改善卵母細胞所處的炎性微環境,從而改善卵母細胞質量及臨床妊娠結局,但其具體機制還有待進一步研究驗證。

本研究通過檢測單個卵泡直徑、體積,FF中sRAGE、Vit D及TNF-α水平以及相應卵母細胞的發育能力,發現胚胎發育良好的卵母細胞的FF中具有更高水平的sRAGE、Vit D和更低水平的TNF-α,提示適當的卵泡微環境對于卵泡健康至關重要。因此,在不孕患者的臨床診療中,選擇具有發育潛能的胚胎,除了依據胚胎形態學評分外,還可以加上卵泡液中sRAGE、Vit D及TNF-α水平的數據,可能對提高IVF臨床妊娠率及不孕患者的診療提供更多幫助。