FSHR基因rs1394205位點多態性與卵巢反應性關系的研究

尹倩倩，鄭建華，曹義娟，嚴曉南，楊冬梓

(1.徐州市中心醫院生殖中心,徐州 221009;2.中山大學附屬孫逸仙紀念醫院生殖中心,廣州 510120;3.徐州市中心醫院婦產科,徐州 221009)

控制性卵巢刺激(COH)是IVF-ET技術的關鍵步驟。在臨床中,不同患者的COH結局具有高度的個體差異。使用相同的促排藥物和劑量,部分患者表現為卵巢的低反應、取卵數過少甚至因此無可移植胚胎;而有些患者卻出現取卵數過多、卵巢過度刺激的癥狀[1-2]。這種過高或過低的卵巢反應均在一定程度上增加了患者的治療時間、經濟花費和生理心理負擔。因此,在COH之前,我們是否能較準確的預測患者的卵巢反應性,并據此制定個體化的促排卵方案顯得非常重要。

目前臨床上最常用的預測卵巢反應性的指標主要有抗苗勒管激素(AMH)、竇卵泡計數(AFC)、基礎卵泡刺激素(bFSH)、基礎FSH/LH比值等。然而,即便以上指標情況相似,仍不能完全消除患者卵巢對促排卵藥物反應的差異性。FSH在卵泡的發育和成熟過程中起著關鍵作用,其受體(FSHR)的基因發生改變,理論上可能會影響其促排卵的效果。本研究將通過檢測IVF患者的FSHR基因rs1394205位點的多態性,探討此位點的基因多態性與卵巢反應性的關系。

材料與方法

一、研究對象

回顧性分析2019年3月至2022年6月在徐州市中心醫院生殖中心接受第一周期IVF-ET的不孕患者327例。納入標準為:(1)年齡≤35歲;(2)輸卵管/盆腔因素(經子宮輸卵管造影或腹腔鏡證實的輸卵管阻塞或輸卵管切除術后)所致的不孕;(3)促排卵方案為黃體期長方案。排除標準為:(1)有排卵障礙性疾病(如多囊卵巢綜合征、高泌乳素血癥等)或甲狀腺、腎上腺功能異常;(2)有卵巢腫物、子宮內膜異位癥或子宮腺肌癥等;(3)有化療、放療、卵巢手術史;(4)有生殖系統先天發育異常;(5)嚴重器質性疾病史。

根據rs1394205位點等位基因的不同(GA型、GG型和AA型)我們將患者分為3組:GA組、GG組和AA組。

本研究通過徐州市中心醫院醫學倫理委員會的批準(倫理批件號:XZXY-LK-20190106-007),所有研究對象均同意加入本研究并在充分知情同意后簽署知情同意書。

二、方法

1.IVF-ET治療:所有接受IVF-ET治療的入組患者均采用黃體期長方案促排卵。于月經周期的黃體中期使用短效促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a,達必佳,輝凌制藥,德國)進行垂體降調節,0.05 mg/d,3 d后改為0.1 mg/d,共使用14 d,降調標準為:FSH<5 U/L,LH<5 U/L,雌二醇(E2)<183.5 pmol/L。達到降調標準后采用FSH150～300 U(果納芬,默克雪蘭諾,瑞士;或麗申寶,珠海麗珠)啟動促排卵,B超監測卵泡的數量、發育情況及子宮內膜厚度,根據患者的卵巢反應性調整促性腺激素(Gn)劑量。當卵泡直徑達到扳機條件,當晚注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)6 000～10 000 U(珠海麗珠)。注射HCG后34～36 h經陰道B超引導穿刺取卵,如可以進行鮮胚移植,則在取卵后72 h在腹部B超引導下進行胚胎移植,冷凍剩余的可利用胚胎。移植后予黃體酮(浙江仙琚)60 mg/d進行黃體支持,2周后抽血檢測β-HCG(HCG>5 U/L為HCG陽性)。陽性者繼續黃體支持,移植后5周B超檢測到宮內孕囊確診為臨床妊娠。

卵巢低反應定義為滿足以下5條中任1條即可[1]:(1)獲卵數≤4枚;(2)HCG日E2≤1 835 pmol/L;(3)平均每日Gn劑量≥300 U;(4)總Gn劑量≥3 300 U;(5)Gn使用天數≥15 d。

2.生殖激素測定:于月經第1～5天,早晨8～9點的安靜狀態下抽空腹肘靜脈血用于基礎生殖激素測定,包括FSH、LH、E2、催乳素(PRL)、AMH。在促排卵過程中抽肘靜脈血監測FSH、LH、E2和孕酮(P)水平。AMH檢測采用酶聯免疫吸附法,其余激素指標檢測采用化學發光免疫分析法。

3.位點多態性的檢測:降調日注射GnRHa前,抽取患者肘靜脈血2 ml置于抗凝管并放入-80℃冰箱內保存留待提取基因組DNA用。按DNA提取試劑盒(OMEGADNA,南京普諾恩生物技術有限公司)操作進行基因組DNA提取。PCR引物:上游TGCAACCCAGAAGGGCTGGT,下游:CAGGAGGGTTGGGCTGGGGA。反應體系:每管加入24 μl預制混合緩沖液,包括2.5 mmol/L dNTP混合液4 μl、50 mmol/L MgCl21.5 μl 、Taq DNA聚合酶0.2 μl,加PCR緩沖液至24 μl),再加入上/下游引物(5 μmol/L)各1 μl、模板1 μl,最后加滅菌蒸餾水至50 μl。反應條件:94℃預變性5 min,94℃變性30 s,55℃復性30 s,72℃延伸40 s,35個循環,終末72℃延伸5 min,后一直4℃保存。PCR反應完成后,使用1.5%的瓊脂糖膠鑒定,使用3730XL型 DNA測序儀(Applied Biosystems,美國)進行測序,采用Chromas軟件分析測序結果。

三、統計學分析

結 果

一、患者的一般情況

研究對象共327例,平均年齡為(29.81±3.17)歲,平均BMI為(21.17±2.95)kg/m2,平均不孕年限為(4.24±2.65)年。

二、rs1394205位點等位基因及基因型頻率

G基因頻率為51.99%,A基因頻率為48.01%。基因型頻率:GG為92例(28.13%),GA為156例(47.71%),AA為79例(24.16%)。基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律[1,4],測序結果詳見圖1。

圖1 FSHR rs1394205位點3種基因型的測序圖

三、不同基因型患者的臨床特征

3組患者間年齡、不孕年限、BMI均無顯著差異(P>0.05);3組患者間的生殖激素水平(bFSH、bLH、AMH、E2)及AFC也均無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 FSHR rs1394205位點3種基因型患者的臨床特征(-±s)

四、不同基因型患者的促排卵周期情況及妊娠結局

GG組患者使用的Gn啟動量及Gn總量較另外兩組患者呈減少趨勢(P=0.070,P=0.129);AA組患者卵巢低反應的發生率較GA組和GG組患者顯著增高(P<0.05);3組患者的HCG日E2值、HCG日直徑≥14 mm卵泡數、獲卵數、可利用胚胎數及臨床妊娠率均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

表2 rs1394205位點3種基因型患者的促排卵周期情況及妊娠結局比較[(-±s),%]

五、二元Logistic回歸分析卵巢低反應發生的影響因素

以是否發生卵巢低反應為因變量,以年齡、BMI、bFSH、bLH、bE2、AMH、AFC、Gn啟動量、Gn總量、是否使用LH及rs1394205位點基因型為自變量進行二元Logistic回歸分析。結果顯示,BMI、AMH、Gn總量及rs1394205位點基因型是發生卵巢低反應的獨立影響因素(P<0.05)(表3)。其中AA基因型患者發生卵巢低反應的概率高于GG型和GA型。

表3 影響卵巢低反應發生的Logistic分析

討 論

FSHR基因的多態性位點超過900個,但有意義的位點較少[3]。目前已報道的突變率較高(Genbank報道的次等位基因頻率>20%)且有意義的位點主要有rs6165、rs6166和rs1394205三個位點[4-5]。近年來,研究比較多的是前兩個位點,且結論基本達成一致,認為這兩個位點可能與卵巢的反應性相關[2,6],并可能與某些種族人群的PCOS發病相關[7]。相較于rs6165和rs6166兩個位點,rs1394205位點的研究較少,且多數研究并未針對其與卵巢反應性的關系。rs1394205位于FSHR基因的核心啟動子上,一項研究顯示該位點AA基因型患者發生早發性卵巢功能不全的概率顯著增加[8]。Busch 等[9]研究顯示此位點的等位基因頻次可能與女孩青春期乳房開始發育時間的早晚有關。另外,有研究認為此位點為AA基因型的男性有較高的bFSH水平[10-11]。當然,近幾年也存在一些研究,認為此位點等位基因的多態性與宮頸癌[12]、PCOS[13]、男性不育的發生風險[14]及男性的糖代謝情況[3]等無明顯相關性。目前,國內外關于此位點與卵巢反應性關系的研究并不多,且研究的結論并不一致[1,4,15-19]。為了排除種族背景差異所致的影響,我們對同為中國漢族人種的3項研究[1,18-19]進行了總結,結果發現這3項研究的結論仍存在爭議,這也是我們進行本研究的主要原因。

本研究中,在卵巢儲備相當的情況下,AA型患者在COH過程中Gn的使用量多于GG型患者,但AA型患者中卵巢低反應的發生率卻顯著高于GG型患者,這與Dan等[18]的研究結論一致。然而,Dan等[18]研究并未排除卵巢儲備不同等因素對卵巢反應性產生的可能影響。為了排除可能的混雜因素的影響,本研究采用二元Logistic回歸分析,發現該位點的AA基因型是卵巢低反應發生的獨立影響因素,這與兩項國外學者的研究結論相一致[4,15]。另外,2021年一篇包含亞洲人種的多中心前瞻性干預研究也從另一個角度支持了本研究的結論,該研究在預期卵巢反應正常的患者中,使用固定150 U劑量的Gn促排卵,該位點GG型患者的獲卵數顯著增加(P<0.05)[20]。然而,國內學者張愛萍等[1]和孫小荷[19]的研究也有不同的觀點,認為該位點的多態性與卵巢反應性并無明顯相關性。造成以上研究結果不一致的原因可能為研究人群的入組標準、樣本量大小、卵巢低反應的定義不同等因素所致。

關于該位點多態性影響卵巢反應性的機制,Desai等[4]的研究認為此位點的AA基因型降低了FSHR基因的轉錄活性,導致FSHR的表達量不同,從而導致患者卵巢反應性的不同,但具體機制仍需進一步的研究確定。

綜上所述,在中國漢族人群中,FSHR基因rs1394205位點的AA基因型是IVF患者卵巢低反應發生的獨立影響因素。