高雄激素通過誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡影響卵巢顆粒細(xì)胞增殖

項(xiàng)雨，丁慧敏，陳田，徐天月，葛紅山*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué),南京 210023;2.泰州市人民醫(yī)院,泰州 225300;3.張家港第一人民醫(yī)院,張家港 215600)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期女性最常見的一種內(nèi)分泌和代謝紊亂的多因素疾病[1],約占無排卵性不孕患者的80%[2]。PCOS最主要的內(nèi)分泌特征是雄激素代謝異常,且高雄激素血癥是PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)和共識(shí)的重要組成部分[3]。雄激素水平的異常升高可對(duì)卵泡發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響,導(dǎo)致卵泡閉鎖,損害卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育[4-5]。環(huán)境中雄激素過高可干擾機(jī)體正常的內(nèi)分泌功能,閉鎖卵泡增加,類固醇激素合成減少,危害機(jī)體的生殖發(fā)育,導(dǎo)致其繁殖力明顯下降[6]。針對(duì)恒河猴和綿羊的研究表明,胎兒在宮內(nèi)暴露的高雄激素環(huán)境與其青春期出現(xiàn)PCOS的臨床表現(xiàn)密切相關(guān),且會(huì)影響其早期卵巢的卵泡發(fā)育[7-8]。

研究表明,高雄激素與炎癥因子密切相關(guān),高雄激素可以增加腫瘤壞死因子(TNF-α)、NF-κB、IL-1、IL-2、IL-6 和 IL-17等炎癥因子的水平[9],而慢性炎癥也是PCOS的典型特征。越來越多的證據(jù)表明PCOS女性血清中炎癥因子的濃度明顯升高[1,10]。長期的慢性炎癥會(huì)進(jìn)一步加重胰島素抵抗和高雄激素血癥,影響類固醇生成和卵泡的閉鎖,進(jìn)而促進(jìn)PCOS的維持[11-12]。最近有研究發(fā)現(xiàn),過量的雄激素可以通過激活炎癥導(dǎo)致小鼠卵巢功能障礙和纖維化[13-14]。總之,慢性炎癥在PCOS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[15],是其發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素。

細(xì)胞焦亡是一種細(xì)胞內(nèi)外穩(wěn)態(tài)失調(diào)的炎癥性的細(xì)胞死亡,表現(xiàn)為與凋亡不同的染色質(zhì)凝集,細(xì)胞腫脹膨大,以及細(xì)胞膜表面出現(xiàn)許多泡狀突出物。它依賴于特異性炎性caspase的激活,導(dǎo)致Gasdermins家族蛋白發(fā)生剪切,其中主要是GSDMD裂解形成N末端和C末端的結(jié)構(gòu)域,活化的N末端在細(xì)胞膜上定位成孔,導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、質(zhì)膜破裂進(jìn)一步釋放炎癥介質(zhì)IL-1β和IL-18[16]。細(xì)胞焦亡的主要途徑包括依賴于Caspase-1的經(jīng)典途徑和非Caspase-1依賴的非經(jīng)典途徑。細(xì)胞焦亡廣泛存在于多細(xì)胞生物的各種組織中,當(dāng)受到誘導(dǎo)因素刺激后,經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的傳遞而激活焦亡。因此本研究擬通過構(gòu)建高雄PCOS動(dòng)物模型及細(xì)胞模型,探究高雄激素對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞增殖的影響。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組:3周齡的ICR小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心,許可證號(hào):SCXK(蘇)2017-007。飼養(yǎng)于安靜、光照明暗交替10 h/14 h、溫度20～25℃、濕度50%～60%的環(huán)境中,自由飲水進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組(對(duì)照組和PCOS組),每組5只。PCOS組每天注射脫氫表雄酮(DHEA,6 mg/100 g體重,溶解在0.1 ml芝麻油和0.01 ml 95%乙醇中),連續(xù)21 d;對(duì)照組小鼠注射等體積不含DHEA的芝麻油。21 d后取小鼠雙側(cè)卵巢,部分凍存于-80℃,部分固定于福爾馬林中,用于后續(xù)處理。

2.細(xì)胞系:人卵巢顆粒細(xì)胞系KGN細(xì)胞由中喬新舟生物科技有限公司提供。KGN 細(xì)胞使用含有 10% FBS(Sigma,美國) 和 1% 青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco,美國)、置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長融合至80%時(shí),睪酮組加入10 μmol/L睪酮[17](上海源葉)處理24 h,同時(shí)對(duì)照組用未添加睪酮的培養(yǎng)基處理24 h。

二、研究方法

1.卵巢組織HE染色:固定后的卵巢組織經(jīng)脫水、包埋、切片、脫蠟、水化、蘇木精和伊紅染色后,顯微鏡觀察兩組小鼠卵巢的形態(tài)學(xué)變化。

2.RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR:將種植于6孔板的KGN細(xì)胞和卵巢組織分別與Trizol(TIANGENG)混合。在每1 ml Trizol中加入0.2 ml 氯仿,旋渦搖勻15 s,冰上孵育10 min后4℃ 12 000 rpm離心15 min。吸取上層水相于新的EP管中,加入等體積異丙醇混勻,冰上放置10 min后4℃ 12 000 rpm離心10 min。棄上清,沉淀中加入1 ml 75% 乙醇混勻后4℃ 7 500 rpm離心5 min。再次重復(fù)上述步驟,棄上清,室溫風(fēng)干5～15 min。最后加入20 μl焦碳酸二乙酯水(DEPC) 重懸 RNA。運(yùn)用FastKing gDNA Dispelllng RT SuperMix(TIANGEN)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR使用SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(TIANGEN),按照說明書在Roche LightCycler480 Ⅱ Real-time qPCR System(Roche)上操作。閾值周期值(Ct)用于確定斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)、胱天蛋白酶酶-1(Caspase-1)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)、NF-κB和IL-1β的表達(dá)水平;然后,以β-actin為內(nèi)參,用公式2-△△Ct計(jì)算。將相對(duì)基因表達(dá)水平與對(duì)照組進(jìn)行比較,所有實(shí)時(shí) 定量PCR 均做3個(gè)復(fù)孔。

基因名稱種屬引物序列(5’-3’)ForwardReverseASChumanGCGCTGGAGAACCTGACCGCCTCCTGCAGGCCCATGTCGCCaspase-1humanCACACCGCCCAGAGCACAAGTCCCACAAATGCCTTCCCGAATACNLRP3humanGATCTTCGCTGCGATCAACAGCGTGCATTATCTGAACCCCACNF-κBhumanTGAACCGAAACTCTGGCAGCTGCATCAGCTTGCGAAAAGGAGCCIL-1βhumanTTACAGTGGCAATGAGGATGACGTGGTGGTCGGAGATTCGTAβ-actinhumanGTTGTCGACGACGAGCGGCACAGAGCCTCGCCTTASCmouseGTCACAGAAGTGGACGGAGTGCTCATCTTGTCTTGGCTGGTGCaspase-1mouseCGTGGAGAGAAACAAGGAGTGAATGAAAAGTGAGCCCCTGACNLRP3mouseCCTGACCCAAACCCACCAGTTTCTTTCGGATGAGGCTGCTTANF-κBmouseAGCTTATGCCGAACTTCTCGGACTCCGGGATGGAATGTAAIL-1βmouseCAGGCAGGCAGTATCACTCATTGCGTCACACACCAGCAGGTTATCβ-actinmouseGTGCTATGTTGCTCTAGACTTCGATGCCACAGGATTCCATACC

3.蛋白免疫印跡(Westerm blotting,WB):提取小鼠卵巢組織和KGN細(xì)胞蛋白,BCA試劑盒(上海碧云天)測(cè)濃度后取20 μg上樣到12%的SDS凝膠進(jìn)行電泳分離,后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,TBST清洗3次。將膜與一抗[NLRP3(1∶1 000)、IL-18(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)、GSDMD(1∶1 000)、Caspase-1(1∶1 000)]在4℃冰箱孵育過夜。第2天用TBST 清洗3遍,每次5 min。之后將膜與二抗HRP Goat Anti-Rabbit IgG(1∶500)或HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rat IgG(1∶5 000)一起室溫孵育2 h。TBST 清洗3遍后顯影檢測(cè)。ImageJ軟件用于量化WB條帶的強(qiáng)度。

4.免疫熒光染色:按1×105細(xì)胞密度接種于12孔板的爬片上,待細(xì)胞生長融合至80%時(shí),棄培養(yǎng)基,PBS清洗3遍。4%多聚甲醛固定15 min后用PBS清洗3遍,然后再用0.5%Triton X-100(碧云天)冰上靜置15 min,PBS再次清洗3遍。封閉液封閉1 h后,將細(xì)胞爬片與一抗(稀釋度為1∶200)一起在4℃冰箱中孵育過夜。第2天用PBS清洗3遍后,將細(xì)胞爬片和二抗(稀釋度為1∶200)一起在濕盒中室溫避光孵育1 h。之后用PBS清洗3遍,并用DAPI避光孵育10 min。最后再次用PBS清洗3遍,用熒光淬滅劑封片后置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

5.細(xì)胞活力測(cè)定:用CCK8試劑盒檢測(cè)KGN的細(xì)胞活力。按1×104細(xì)胞密度接種于96孔板,每孔100 μl細(xì)胞懸液,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長融合至80%時(shí),對(duì)照組直接加入培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組加入分別含有1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L睪酮的培養(yǎng)基,每組各做6個(gè)復(fù)孔,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μl CCK8溶液,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min,之后用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm的吸光度值。

6.LDH釋放實(shí)驗(yàn):用 LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(C0016,上海碧云天)來測(cè)定培養(yǎng)基中LDH的釋放量。按1×104細(xì)胞密度接種于96孔板中,待細(xì)胞生長融合至80%時(shí),分別用不同濃度的睪酮(0、1、10、100 μmol/L)處理24 h,每組3個(gè)復(fù)孔。釋放實(shí)驗(yàn)的步驟根據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、PCOS小鼠模型卵巢形態(tài)學(xué)變化

鏡下觀察對(duì)照組和PCOS組卵巢最大橫截的形態(tài)、各級(jí)卵泡及黃體的變化,對(duì)照組可見不同時(shí)期的發(fā)育卵泡和排列整齊的顆粒細(xì)胞層(圖1A);PCOS組卵巢內(nèi)可見囊狀擴(kuò)張的卵泡,卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞層減少,黃體數(shù)量減少,卵母細(xì)胞消失,未成熟小卵泡及閉鎖卵泡明顯增多(圖2A、表1)。另外,雖然給藥前兩組小鼠體重?zé)o顯著差異,但給藥后兩組小鼠的體重及增重均發(fā)生顯著改變(P<0.05)(表2)。

表1 兩組小鼠卵巢組織中卵泡及黃體數(shù)量比較(-±s)

表2 兩組小鼠給藥前后的體重變化(-±s)

A:對(duì)照組,黃色箭頭示不同時(shí)期的發(fā)育卵泡;B:PCOS組,黑色箭頭示囊狀擴(kuò)張的卵泡,紅色箭頭示未成熟小卵泡及閉鎖卵泡。

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

二、PCOS小鼠卵巢組織中炎癥及焦亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)情況

為了確定PCOS小鼠卵巢是否存在炎癥及異常焦亡的激活,分別檢測(cè)了對(duì)照組和PCOS組小鼠卵巢組織中炎癥及焦亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。GSDMD為焦亡通路的關(guān)鍵蛋白,其被激活后裂解為GSDMD-N起作用,故此次WB統(tǒng)計(jì)分析時(shí)用N-GSDMD/GSDMD代表焦亡水平。PCR結(jié)果顯示,PCOS小鼠卵巢組織中NLRP3、NF-KB、IL-1β、ASC和Caspase-1的mRNA水平顯著升高(P<0.05)(圖2)。WB的結(jié)果也表明炎癥相關(guān)蛋白(NLRP3、IL-1β、IL-18)和焦亡相關(guān)蛋白(Caspase-1、N-GSDMD/GSDMD)的水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(圖3)。

注:GSDMD-N/GSDMD代表焦亡水平;與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

三、不同KCN細(xì)胞組的細(xì)胞炎癥和焦亡的相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)

為了進(jìn)一步確定高濃度的雄激素對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的影響,使用睪酮(10 μmol/L)處理KGN細(xì)胞后,分別觀察睪酮組和對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)的變化并研究在高雄激素環(huán)境中顆粒細(xì)胞炎癥及焦亡相關(guān)基因和蛋白的變化。對(duì)照組KGN細(xì)胞呈成纖維樣或梭形并向周圍伸出偽足;睪酮給藥處理后的細(xì)胞逐漸腫脹變圓,出現(xiàn)明顯的焦亡征象即細(xì)胞膜表面出現(xiàn)許多的突出小泡(圖4)。與對(duì)照組相比,睪酮組中NLRP3、NF-KB、IL-1β、ASC和Caspase-1的mRNA水平顯著升高(圖5)。WB及免疫熒光的結(jié)果顯示,焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1及N-GSDMD/GSDMD在睪酮組中的水平顯著高于對(duì)照組(圖6圖7)。

A:對(duì)照組;B:睪酮(10 μmol/L)組

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。

注:GSDMD-N/GSDMD代表焦亡水平;與對(duì)照組比較,**P<0.01。

圖7 兩組KGN細(xì)胞中焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)(免疫熒光 ×1 000)

四、睪酮對(duì)KGN細(xì)胞活力及增殖的影響

為了研究在高雄激素環(huán)境中卵巢顆粒細(xì)胞生長是否受損,我們首先通過體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的睪酮對(duì)細(xì)胞活力的影響。分別用1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L的睪酮處理KGN細(xì)胞24 h后用CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖,結(jié)果表明,隨著睪酮濃度的增加細(xì)胞存活率逐漸下降(圖8)。之后我們通過LDH釋放實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞活性,通過吸光度測(cè)定發(fā)現(xiàn)睪酮處理后細(xì)胞的活性降低,且在10 μmol/L時(shí)LDH的釋放量最大(圖9)。

圖8 不同濃度睪酮處理24 h后KGN細(xì)胞的存活率

注:與對(duì)照組比較,**P<0.01。

討 論

PCOS是育齡期婦女出現(xiàn)生殖功能障礙最常見的原因,多存在卵巢功能受損,卵泡發(fā)育及類固醇的生成異常[18]。而高雄激素血癥是PCOS最主要的內(nèi)分泌特征之一,不僅是PCOS重要的臨床表現(xiàn),還是其主要的病因[19]。目前許多研究已經(jīng)證實(shí),高雄激素與PCOS代謝紊亂及卵巢功能障礙密切相關(guān),但其具體機(jī)制尚未完全明確。

研究表明,體內(nèi)的高雄激素環(huán)境可增加促炎因子的水平,而炎癥的異常累積會(huì)損害卵巢功能,進(jìn)一步促進(jìn)PCOS的發(fā)生發(fā)展[20]。越來越多的證據(jù)表明,慢性低度的炎癥狀態(tài)是PCOS長期持續(xù)的重要因素[11]。本研究也表明,在高雄激素誘導(dǎo)的PCOS小鼠模型中炎癥相關(guān)基因(NLRP3、NF-KB、IL-1β)和蛋白(NLRP3、IL-1β、IL-18)的表達(dá)水平均顯著升高,且Caspase-1及N-GSDMD/GSDMD的表達(dá)水平也較對(duì)照組增加。因此我們推測(cè)高雄激素在促進(jìn)PCOS炎癥激活的同時(shí)也誘導(dǎo)了焦亡的發(fā)生。

在我國,卵泡功能障礙是導(dǎo)致PCOS不孕的主要原因[21],且卵巢顆粒細(xì)胞在卵泡發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。為了進(jìn)一步確定高雄激素對(duì)炎癥及焦亡的影響,我們用睪酮處理KGN細(xì)胞來模擬PCOS患者體內(nèi)的高雄激素狀態(tài)。細(xì)胞焦亡是一種炎癥性的細(xì)胞死亡,過度的炎癥激活可促進(jìn)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[22]。在睪酮的刺激下,炎癥相關(guān)基因水平均顯著升高。光鏡下觀察到睪酮組細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了明顯變化,失去原有細(xì)胞形態(tài)逐漸腫脹變圓,細(xì)胞膜表面出現(xiàn)許多突出小泡,為焦亡的典型特征。此外,睪酮也增加了KGN細(xì)胞中Caspase-1和N-GSDMD/GSDMD的表達(dá)水平。這些數(shù)據(jù)表明,睪酮促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞炎癥及焦亡的異常激活。我們還發(fā)現(xiàn)隨著睪酮濃度的增加,卵巢顆粒細(xì)胞的增殖也受到影響,因此我們推測(cè)高雄激素可通過誘導(dǎo)焦亡來影響卵巢顆粒細(xì)胞增殖,進(jìn)而影響卵泡及卵母細(xì)胞的質(zhì)量,最終導(dǎo)致不孕。

目前PCOS的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,而焦亡可能在PCOS的發(fā)生發(fā)展中起作用[23]。根據(jù)我們的研究,高雄激素可以激活慢性炎癥,從而誘發(fā)卵巢顆粒細(xì)胞焦亡,影響其增殖,有助于為PCOS的治療提供新思路。后續(xù)還需進(jìn)一步研究高雄調(diào)控細(xì)胞焦亡,影響PCOS卵巢功能和生殖能力的可能機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)僅發(fā)現(xiàn)了PCOS模型小鼠卵巢組織中炎癥及焦亡相關(guān)蛋白水平的異常,未進(jìn)一步研究PCOS小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中相關(guān)基因及蛋白的變化情況,此為本實(shí)驗(yàn)的不足之處,后續(xù)將進(jìn)一步研究PCOS小鼠模型卵巢顆粒細(xì)胞中焦亡及炎癥的變化情況。