富血小板血漿治療卵巢早衰的研究進展

胡倩瑜，王卓敏，吳唯，顧穎，孫濤，徐鍵

(浙江大學醫學院附屬第四醫院生殖醫學中心,義烏 322000)

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是指在40歲之前出現卵巢功能衰竭的一種生殖內分泌疾病,以原發或繼發性閉經為主要特征,伴隨血清卵泡刺激素水平升高和雌激素水平降低,表現為潮熱多汗、面部潮紅、性欲低下等。其全球發病率約1%～2%,在我國發病率可達3%[1]。近年來,卵巢早衰的發病率逐年上升,發病年齡逐年提前,而女性的生育年齡逐年推后,生育問題成了國家社會難題,亟待解決。然而,卵巢早衰是一個遞進過程。在早期,患者體內仍殘存一定數量的卵泡,若在此時及早進行干預,也許可以挽救其生育能力。有研究表明,富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)具有保護卵巢功能的作用[2]。本文針對PRP的功能來探討PRP治療卵巢早衰的可能作用機制。

一、卵巢早衰的發病機制研究進展

卵巢作為女性的性腺,其主要作用為分泌生殖激素和產生卵母細胞。卵巢總卵泡數量有限且不可補充[3]。隨著女性年齡的增長,卵泡數量逐年減少,從胚胎時期的600萬～700萬個生殖細胞消減至圍絕經期幾千枚卵泡數量。若卵泡數量減少過快,可能會導致卵巢早衰,但這個過程復雜,病因繁多,發病機理不詳。

1.氧化應激與卵巢早衰:卵巢早衰與氧化應激息息相關。氧化應激可引起異常卵泡閉鎖,損害卵母細胞減數分裂,縮短端粒酶壽命,影響線粒體功能[4]。線粒體功能障礙是衰老的標志之一,在線粒體中,存在一種蛋白酶可以去除錯誤折疊和聚集的蛋白質來維持蛋白質穩態和線粒體質量。若小鼠中線粒體蛋白酶缺失,將會導致卵巢卵泡數量減少和抗繆勒管激素降低,表現為卵巢早衰的臨床癥狀。線粒體DNA是衡量線粒體功能的另一個指標,單個卵母細胞包含數十萬個線粒體DNA,這些線粒體DNA可以提供足夠的ATP來保證精卵結合并支持胚胎發育。線粒體DNA拷貝數會隨著年齡的增長在各種組織中持續下降[5],但在卵巢早衰期間,線粒體DNA拷貝數下降速度會更快。

2.卵巢周圍環境的衰老:卵巢早衰不僅僅是卵母細胞的衰老,還包括周圍環境的衰老[6],包括顆粒細胞及細胞外基質。顆粒細胞是組成卵泡的最大細胞群,是雌孕激素的主要來源[7]。顆粒細胞可以分為兩組:一組是緊鄰基膜的壁層顆粒細胞,排卵后壁層顆粒細胞就變成黃體細胞的一部分,產生支持胚胎植入子宮內膜的孕激素;另一組是環繞在卵母細胞周圍的卵丘細胞,它能夠促使卵母細胞成熟[8]。在卵巢衰老過程中,顆粒細胞凋亡壞死,影響miRNA功能作用,減少雌激素的分泌,最終導致卵泡閉鎖。Jiang等[9]發現顆粒細胞中的m6A mRNA去甲基化酶可延緩卵巢衰老的進展,這也側面說明顆粒細胞可影響卵巢功能。

卵巢的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)包含基底層、卵丘-卵母細胞復合體和基質。卵泡最初被卵巢基質包圍,后從卵巢皮層移動到柔韌的髓質中發育生長,最終回到卵巢皮層排卵[10]。卵巢基質中含有豐富的免疫細胞,其中最豐富的細胞是巨噬細胞。巨噬細胞可以經典地活化成M1,交替活化成M2表型。Zhang等[11]發現隨著年齡的增長,巨噬細胞的總數不會改變,M1/M2的比例卻會改變,主要表現為M2巨噬細胞增加,M1巨噬細胞減少。前者在感染后期活躍,重塑ECM和促進組織修復,導致卵巢纖維化,是衰老的表現之一。后者存在于炎癥的急性期,產生促炎細胞因子,如IL-6和TNF-α,在衰老卵巢中含量豐富。此外,除了M1和M2細胞外,在老年卵巢中還發現了獨特的多核巨噬細胞群[12]。這些都暗示衰老卵巢周圍微環境與免疫應答息息相關。

3.目前涉及卵巢早衰的信號通路:卵巢功能的平衡往往由卵巢儲備功能的消耗及原始卵泡的激活來決定[13]。在原始卵泡的激活過程中,存在兩條重要信號通路:PTEN/PI3K/Akt信號通路和FOXO3a的磷酸化[14]。PTEN/PI3K/Akt信號通路是控制原始卵泡募集和生長的信號通路之一,其主要作用是使細胞生長、分化和新陳代謝,以及維持基因組完整性。該信號通路加速,可能導致原始卵泡過度激活[15]。非磷酸化的FOXO3a維持原始卵泡處于靜止狀態[5]。反之,FOXO3a的過度磷酸化會導致原始卵泡的整體激活,進而卵巢早衰[10]。在這個過程中,顆粒細胞的雷帕霉素復合物1(mammalian target of rapamycin,mTOR) 可促進KIT配體產生,在卵母細胞中激活KIT和PI3K/Akt信號傳導通路和FOXO3a磷酸化,不可逆地啟動原始卵泡發育,從而導致卵巢早衰的發生。

二、目前治療卵巢早衰的策略

目前POF的治療手段繁多,在臨床上常以激素補充治療為主,輔以促排卵、生育力保存(胚胎、卵母細胞、卵巢組織凍存等)治療等[16]。在基礎研究中常有免疫療法、干細胞療法、體外活化、線粒體活化、干細胞和外泌體治療、PRP等等[17-18]。

三、PRP治療卵巢早衰的機制

正常人體的血小板計數在1.5×1012～3.5×1012/L之間,主要起止血功能。富血小板血漿是將動物或人的全血經過離心后去除紅細胞及白細胞得到的富含高濃度血小板的血漿,其血小板計數可達10×1012/L以上[19]。血小板主要含α顆粒及致密顆粒。α顆粒的激活可釋放300種以上與再生相關的生物活性因子,比如:成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)、轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-I)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)等[20]。這些生長因子具有促進血管生成[21],抗免疫炎癥[22]等作用,這在一定程度上能恢復卵巢的組織形態、彈性和韌性,減少卵巢組織纖維化[23](表1)。

1.PRP調控血管生成減少卵巢內氧化應激而保護卵巢組織:卵巢組織具有豐富的血管條件,其血供主要來自卵巢動脈以及子宮動脈的輸卵管支,調控氧供平衡,為卵巢中竇卵泡的發育提供能量[24-25],而血管的生成與PDGF受體有關。在卵母細胞和顆粒細胞中均有PDGF受體的表達,大鼠卵巢中PDGF受體的抑制常導致卵泡閉鎖增加,初級卵泡形成減少,以及卵巢內血管生成減少,最終導致卵巢早衰。同時,在一項卵巢老化的橫斷面研究中,卵巢早衰患者卵泡液中的PDGF的含量遠較正常組低[26]。而PRP中的α顆粒包含PDGF。Ahmadian等[21]發現將PRP注射至卵巢組織中,可增加α-平滑肌動蛋白血管單位,從而誘導卵巢組織血管形成,恢復卵巢早衰大鼠的排卵率,促進其恢復活力。Bakacak等[22]研究發現PRP對大鼠卵巢缺血和再灌注損傷具有保護作用,主要通過血管生成維持卵巢灌注,增加卵巢活力,減少白細胞聚集,防止由白細胞引起的自由基損傷從而達到抗氧化應激的作用。這些研究表明PRP具有調控血管生成的能力,可以減少卵巢內氧化應激,從而保護卵巢組織,延緩卵巢早衰進程。

2.PRP可穩定卵巢微環境,為卵泡發育成熟提供條件:PRP中的致密顆?？舍尫欧€定組織內環境所必需的鈣離子、血清素、組胺、多巴胺、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷等[20]。有研究表明:PRP可作為卵母細胞體外培養的胎牛血清替代品,具體而言,添加PRP的培養基支持卵母細胞中卵丘擴展、體外胚胎發育和囊胚冷凍存活,保護卵母細胞免受如線粒體活性降低及胞質內脂質的額外累積等的應激影響[27]。

另外,卵泡的發育需要多種因子的共同調節,其中許多因子都是PRP中所包含的。TGF-β在卵泡發育中起關鍵性作用,包括募集原始卵泡,調控顆粒細胞和卵泡膜細胞增殖或者閉鎖,生成類固醇,表達促性腺激素受體,促進卵母細胞成熟、排卵、黃體化等[28]。TGF-β超家族中另含有生長分化因子9。生長分化因子9基因表達也被認為是卵母細胞成熟電位的生物標志物,其突變與卵巢早衰有關[29]。PDGF可通過增加卵巢的血供延緩卵巢早衰的進展[21,30],而PDGF靶基因的突變可影響卵巢功能和子宮形態等。IGF-1能與多種生物活性因子起協同作用,以外源性GnRH為例,IGF-1能放大其在顆粒細胞和卵泡膜細胞上的作用,促進卵泡生長發育[31]。

3.PRP通過PI3K/Akt/PKB信號通路促進卵泡發育成熟:富血小板血漿中的多種因子可以通過PI3K/Akt/PKB信號通路促進卵泡發育成熟。較早可追溯至2000年,Taylor[32]研究發現,PRP中的PDGF可刺激PDGF-Rβ的酪氨酸磷酸化,激活體內信號通路,包括PI3K/Akt/PKB和Ras/Raf/MEK/ERK等途徑,使細胞生長加速和類固醇發生抑制,對體內卵泡發育和生長起重要作用。VEGF可結合并激活VEGF受體,從而激活PI3K/AKT/mTOR通路,PI3K/AKT通過磷酸化GSK3-β信號使GSK3-β失活,啟動內源性VEGF信號傳導的激活,導致卵巢血管的血管重塑,并最終使卵泡生長發育[33]。有研究發現PRP可與酪氨酸激酶膜結合受體(receptor tyrosine kinase,RTK)結合來調節細胞生長和增殖[34]。RTK激活需要整合素受體能力[35],生長因子受體激活導致RTK亞群增強[36]。來自生長因子的信號與mTOR結合,激活下游絲氨酸、蘇氨酸激酶p70S6k以激活休眠卵泡,促進卵泡生長發育。

四、總結及展望

目前臨床上對于富血小板血漿的應用主要聚焦于皮膚學、整形外科和美容外科等,它的原理與再生醫學息息相關[44],在生殖醫學具有廣泛的應用前景。PRP在卵巢早衰的應用,國內最早可追溯于2019年廣州中醫藥大學的臨床對照研究[45],但后續基礎研究國內并未報導,并且對于PRP的來源、制備、激活國內外均無統一的標準。在來源上,富血小板血漿來源可簡單分為成人外周血及臍帶血。有研究證明,相同濃度下由臍帶血制備的富血小板血漿中含有更多的生長因子,例如PDGF-AB,PDGF-BB和FGF-2,VEGF和趨化因子RANTES等[46]。這可能會使由臍帶血制備的PRP治療卵巢早衰具有更好的療效。在制備上,低濃度PRP(約較正常血小板增加3倍)往往比高濃度的PRP(約較正常血小板增加7倍)具有更好的治療效果,這可能跟高濃度血小板存在負反饋機制相關[21]。在激活方面,使用凝血酶或鈣離子激活可使生長因子的組成改變。有些研究使用靜止狀態的富血小板血漿[47],有些研究使用活化后的富血小板血漿,對卵巢早衰的治療都有益處,但缺乏深入的比較。目前大多數文獻聚焦于卵巢早衰的治療,但卵巢早衰是一個由量變引起質變的過程,防范于未然可能是更好的方式,富血小板血漿對卵巢的預防作用可能成為卵巢早衰的一個新興研究方向。