血清Sirt1、Sestrin2與2型糖尿病并發(fā)糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的關(guān)系研究*

關(guān)曉燕,王麗娟,寧聰華,閆雪梅,包建玲

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,新疆烏魯木齊 830054

2型糖尿病(T2DM)屬于一種內(nèi)分泌代謝綜合征,臨床表現(xiàn)為多飲、多食、多尿、消瘦或體質(zhì)量下降,在我國成年人中T2DM患病率達(dá)10.9%[1]。目前T2DM尚無根治性手段,若血糖長期得不到有效控制,將導(dǎo)致多種慢性并發(fā)癥,嚴(yán)重時(shí)可危及生命安全[2]。糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)為T2DM并發(fā)癥之一,發(fā)生率為10%～96%,常見臨床癥狀有感覺障礙(肢端麻木、疼痛、燒灼感等)與肢體改變(關(guān)節(jié)變形、皮膚潰爛等),足部潰瘍嚴(yán)重者需截肢[3]。因此,研究DPN發(fā)病的影響因素對于預(yù)防或延緩DPN具有重要意義。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在T2DM發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色,被認(rèn)為是引發(fā)其慢性并發(fā)癥的共同機(jī)制[4-5]:(1)氧化應(yīng)激可下調(diào)細(xì)胞質(zhì)嵌膜蛋白小窩蛋白-1(Cav-1)表達(dá)水平,促使DPN的發(fā)生;(2)前炎性細(xì)胞因子可與細(xì)胞外Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合,經(jīng)由細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)激活核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB),進(jìn)而誘導(dǎo)單核、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子,引發(fā)炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致DPN的發(fā)生。Sestrin2是一種應(yīng)激誘導(dǎo)型蛋白,能夠參與葡萄糖代謝調(diào)節(jié)及體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài),生理?xiàng)l件下表達(dá)較低,而在氧化應(yīng)激時(shí)其表達(dá)水平可明顯上調(diào),以減少活性氧(ROS)累積[6]。有研究表明,Sestrin2可通過多種信號(hào)途徑防御各種病理性改變,如脂質(zhì)代謝異常、胰島素抵抗等,并與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)[7]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)是一種多功能蛋白,能夠參與調(diào)控糖脂代謝及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng),在糖尿病大鼠中呈低表達(dá),并與神經(jīng)病變有一定聯(lián)系[8]。鑒于上述背景,筆者推測Sirt1、Sestrin2與DPN可能有一定關(guān)系,為驗(yàn)證這一猜想,本研究擬分析血清Sirt1、Sestrin2與T2DM并發(fā)DPN患者的關(guān)系,為臨床T2DM患者并發(fā)DPN診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),選取2020年3月至2022年3月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的T2DM患者142例,根據(jù)DPN發(fā)生情況分為非DPN組(85例)和DPN組(57例),另選取同期體檢健康者為健康對照組(50例)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)[9];(2)年齡≥18歲;(3)T2DM病程0.5～20.0年;(4)無精神系統(tǒng)疾病或其他內(nèi)分泌疾病;(5)病歷資料完整;(6)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)1型糖尿病;(2)有其他病因?qū)е碌纳窠?jīng)病變?nèi)缟窠?jīng)壓迫、椎管狹窄等;(3)存在交流障礙;(4)合并惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重感染;(5)妊娠及哺乳期婦女。非DPN組中,男47例,女38例;年齡27～80歲,平均(61.62±8.36)歲;體質(zhì)量指數(shù)(BMI)19～26 kg/m2,平均(22.36±2.10)kg/m2。DPN組中,男35例,女22例;年齡29～79歲,平均(64.24±9.78)歲;BMI 20～26 kg/m2,平均(22.89±2.43)kg/m2。健康對照組中,男31例,女19例;年齡25～79歲,平均(63.20±8.83)歲;BMI 19～25 kg/m2,平均(22.24±2.37)kg/m2。3組性別、年齡、BMI差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[9]中關(guān)于T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)出現(xiàn)典型糖尿病癥狀(煩渴多飲、多尿、多食、不明原因的體重下降)加上糖負(fù)荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L;(2)空腹時(shí)的血漿葡萄糖濃度≥7.0 mmol/L;(3)葡萄糖負(fù)荷后2 h血糖無典型糖尿病癥狀者,需改日復(fù)查確認(rèn),血漿葡萄糖濃度≥11.1 mmol/L。

1.2.2DPN診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[9]中關(guān)于DPN的診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)明確的T2DM病史;(2)T2DM診斷時(shí)或之后發(fā)生的周圍神經(jīng)病變;(3)臨床癥狀和體征與DPN表現(xiàn)符合;(4)存在疼痛、感覺異常、麻木等癥狀,進(jìn)行5項(xiàng)檢查(震動(dòng)覺、踝反射、針刺痛覺、溫度覺、壓力覺)時(shí),發(fā)現(xiàn)任意1項(xiàng)異常;(5)排除其他病變?nèi)珙i腰椎病變(神經(jīng)根壓迫、椎管狹窄、頸腰椎退行性變),腦梗死,格林-巴利綜合征,嚴(yán)重動(dòng)靜脈血管病變(靜脈栓塞、淋巴管炎)等,尚需鑒別藥物尤其是化療藥物引起的神經(jīng)毒性作用及腎功能不全引起的代謝毒物對神經(jīng)的損傷。

1.3方法

1.3.1臨床資料收集 收集患者的臨床資料包括:T2DM病程、BMI、年齡、性別、吸煙史(每天吸煙≥1支且時(shí)間≥6個(gè)月)、飲酒史(每周飲酒≥1次且時(shí)間≥6個(gè)月)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)發(fā)生情況、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血肌酐(Scr)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、載脂蛋白A1(ApoA1)、載脂蛋白B(ApoB)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、血清Sirt1、Sestrin2等。

1.3.2外周血指標(biāo)檢測 (1)外周血采集:T2DM患者于入院次日清晨、體檢健康者于體檢當(dāng)日采集空腹靜脈血5 mL,3 000 r/min離心處理30 min,半徑10 cm,分離上層清液,置于冰箱-20 ℃保存。(2)血清指標(biāo)檢測:采用邁瑞B(yǎng)S-420全自動(dòng)生化分析儀(武漢盛世達(dá)醫(yī)療設(shè)備有限公司)檢測血清TG、TC、LDL、HDL、Scr、HbA1c、ApoA1、ApoB。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清Sirt1、Sestrin2水平,血清Sirt1試劑盒購自上海科艾博生物技術(shù)有限公司,血清Sestrin2試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司。硫代巴比妥酸法檢測丙二醛MDA水平,試劑盒購自上海富雨生物科技有限公司。黃嘌呤氧化酶法檢測SOD,試劑盒購自武漢賽培生物科技公司。Fe3+/Fe2+還原法檢測T-AOC,試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3.3外周血單核細(xì)胞TLR-4和NF-κB信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)水平檢測 (1)分離外周血單核細(xì)胞:Ficoll密度梯度離心法。向離心管中加入人淋巴細(xì)胞分離液2 mL(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司),再將0.9%氯化鈉溶液1 mL(上海源葉生物科技有限公司)與外周靜脈血1mL混合后加入離心管中,經(jīng)3 500 r/min離心處理30 min,收集離心管內(nèi)1～2層交界處(由下至上分為3層)的白色云霧狀液體(以單核細(xì)胞為主),并加至4mL 0.9%氯化鈉溶液中,以1 500 r/min離心處理10 min,即可獲取目的細(xì)胞。(2)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測:Trizol試劑盒(沈陽萬類生物科技有限公司)提取細(xì)胞總RNA,Thermo超微量紫外分光光度計(jì)(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司)測RNA濃度、純度,Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(溫州科淼生物科技有限公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過ABI7500PCR儀(上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司)檢測,反應(yīng)體系(20 μL)如下,cDNA 1 μL、2×SYBR Green Mix10 μL、去離子水7.4 μL、上下游引物10 μmol/L分別0.8 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,循環(huán)40個(gè)。溶解曲線的反應(yīng)條件為:95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,1.6 ℃/s速度。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖電泳分離,以2-ΔΔCt法計(jì)算TLR-4和NF-κB mRNA相對表達(dá)水平。引物序列如下,內(nèi)參U6:上游5′-TTGCCGACAGGATGCAGAA-3′,下游5′-GCCGATCCACACGGAGTACT-3′;TLR-4:上游5′-CTACCCTGCGGAGATCAC-3′,下游5′-TAGGACAGCCAGGCCAGCAACA-3′;NF-κB:上游5′-TCACCCTGAGATGGGAGC-3′,下游5′-AGCTCTTCCTCCTCCACAT-3′。

2 結(jié) 果

2.1非DPN組與DPN組基本資料比較 DPN組年齡大于非DPN組(P<0.05),T2DM病程長于非DPN組(P<0.05),HbA1c水平高于非DPN組(P<0.05),TG、HDL水平低于非DPN組(P<0.05),DR發(fā)生率高于非DPN組(P<0.05)。見表1。

表1 研究對象基本資料[n(%)或

2.2健康對照組、非DPN組、DPN組血清Sirt1、Sestrin2水平比較 與健康對照組比較,非DPN組和DPN組血清Sirt1水平降低(P<0.05),血清Sestrin2水平升高(P<0.05);與非DPN組比較,DPN組血清Sirt1、Sestrin2水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 健康對照組、非DPN組、DPN組血清Sirt1、Sestrin2水平比較

2.3非DPN組與DPN組氧化應(yīng)激指標(biāo)及外周血單核細(xì)胞TLR-4、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較 與非DPN組比較,DPN組血清MDA及外周血單核細(xì)胞TLR-4、NF-κB mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05),血清SOD水平降低(P<0.05),血清T-AOC水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 非DPN組與DPN組氧化應(yīng)激指標(biāo)及外周血單核細(xì)胞TLR-4、NF-κB mRNA表達(dá)水平比較

2.4分析血清Sirt1、Sestrin2與氧化應(yīng)激指標(biāo)、外周血單核細(xì)胞 TLR-4和NF-κB mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性 Pearson檢驗(yàn)結(jié)果顯示,血清Sirt1、Sestrin2與SOD呈正相關(guān)(P<0.05),與MDA、TLR-4、NF-κB呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 相關(guān)性數(shù)據(jù)

2.5T2DM患者發(fā)生DPN的多因素分析 建立非條件Logistic回歸模型,以本研究資料為樣本,以T2DM患者發(fā)生DPN情況為應(yīng)變量,賦值DPN=1,非DPN=0。以前述研究對象基本資料(表1)中P<0.05的指標(biāo)和因素為自變量。將部分為連續(xù)數(shù)值的自變量,按兩組總均值(適當(dāng)取整)進(jìn)行分段(分層),轉(zhuǎn)化成兩分類變量。回歸過程采用逐步向前法,并反復(fù)試驗(yàn)優(yōu)化調(diào)整自變量納入順序,以利先剔除部分因素(α剔除=0.10,α入選=0.05)。結(jié)果顯示,年齡增大(≥63歲)、T2DM病程偏長(≥8年)、HbA1c水平升高(≥9%)、DR、HDL水平降低(<1 mmol/L)、Sirt1水平降低(<8 ng/mL)、Sestrin2水平降低(<14 ng/mL)是DPN的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表5。

表5 T2DM患者發(fā)生DPN的多因素分析

3 討 論

DPN為T2DM的并發(fā)癥之一,主要病理改變?yōu)樯窠?jīng)受損,其發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)[9-11]。臨床預(yù)防DPN除了控制高血糖外,還需關(guān)注氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等導(dǎo)致病情進(jìn)一步發(fā)展的各種因素。MDA、SOD、T-AOC為氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)[12-14]。MDA是組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(LPO)的終產(chǎn)物之一,可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平;SOD為一種金屬蛋白酶,其活性高低可反映組織自由基水平及脂質(zhì)過氧化程度;T-AOC表示人體內(nèi)非酶類與酶類抗氧化物總體水平,可以清除過高水平的ROS,維持體內(nèi)氧化還原相對平衡。本研究中,與非DPN組比較,DPN組血清MDA水平升高,血清SOD水平降低,血清T-AOC無明顯差異,提示氧化應(yīng)激參與了T2DM患者的DPN發(fā)病過程。TLR-4/NF-κB作為信號(hào)傳導(dǎo)通路在炎癥反應(yīng)中起重要作用,TLR-4能夠識(shí)別細(xì)菌脂多糖,與其結(jié)合后可以激活NF-κB通路,進(jìn)而引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15]。相關(guān)基礎(chǔ)研究顯示,DPN大鼠坐骨神經(jīng)組織TLR4和NF-κB表達(dá)水平較健康大鼠升高[16],提示TLR-4/NF-κB在DPN中呈異常激活狀態(tài),與DPN形成密切相關(guān),經(jīng)治療干預(yù)后TLR4/NF-κB蛋白水平明顯減少,說明TLR-4/NF-κB通路可能與DPN進(jìn)展和療效相關(guān),提示DPN發(fā)病過程中存在炎癥反應(yīng)過度激活的現(xiàn)象。

生理狀況下,ROS在機(jī)體內(nèi)水平極低,而且可被內(nèi)源性的抗氧化系統(tǒng)有效清除;病理?xiàng)l件下,機(jī)體內(nèi)ROS大量生成,抗氧化酶活性減弱,機(jī)體傾向于氧化狀態(tài),則會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)[17]。Sestrin2作為一種應(yīng)激誘導(dǎo)型蛋白,除具有抗氧化應(yīng)激作用外,還在抗炎、抑制過度免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要效應(yīng),在代謝紊亂、神經(jīng)病變等病理情況下,體內(nèi)會(huì)代償性分泌Sestrin2蛋白,發(fā)揮正向的保護(hù)效果。有研究顯示,糖尿病腎病發(fā)生時(shí)Sestrin2水平降低,并可激活YAP-TEAD1通路促使系膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成[18]。Sestrin2水平降低已被證實(shí)會(huì)造成諸多不良影響,如胰島素抵抗、糖尿病加速等[19]。研究顯示,T2DM患者外周血中Sestrin2水平上升,在代謝紊亂中起關(guān)鍵作用[20],這與本研究結(jié)果有相符之處,即非DPN組和DPN組血清Sestrin2水平較健康對照組升高,Sestrin2具有抗氧化特性,Sestrin2水平升高或許是保護(hù)患者機(jī)體免受氧化應(yīng)激損害的代償反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示,Sestrin2在DPN組患者血清中的水平明顯低于非DPN組患者,可能是由于隨著T2DM病情進(jìn)展,Sestrin2代償機(jī)制不足以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,其表達(dá)逐步減少。此外,Sestrin2水平降低為DPN的危險(xiǎn)因素,說明高水平Sestrin2對DPN發(fā)揮保護(hù)作用,其水平降低可能會(huì)促進(jìn)DPN發(fā)生,提示Sestrin2有望成為DPN的臨床預(yù)測指標(biāo)。與此同時(shí),本研究還發(fā)現(xiàn),DPN患者Sestrin2水平與SOD呈正相關(guān),與MDA、TLR-4、NF-κB呈負(fù)相關(guān),提示上調(diào)Sestrin2水平或許可通過下調(diào)體內(nèi)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而影響DPN的發(fā)生。

Sirt1是一種去乙酰化酶,能夠參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、新陳代謝、基因轉(zhuǎn)錄、糖脂代謝、胰島素分泌、炎癥反應(yīng)等,還可通過調(diào)控NF-κB、P53、eNOS等靶基因或蛋白而參與氧化應(yīng)激損傷過程[21]。近年來,Sirt1的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)已在局部缺血性損傷、創(chuàng)傷性腦損傷及神經(jīng)退行性疾病中得到證實(shí)[22]。有細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,在高糖刺激下,內(nèi)皮細(xì)胞中Sirt1蛋白表達(dá)量明顯降低,Sirt1激動(dòng)劑白藜蘆醇有助于減輕高糖所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷[23]。有大鼠模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與健康大鼠比較,DPN模型大鼠的Sirt1水平明顯下調(diào),經(jīng)補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后DPN大鼠的Sirt1水平明顯升高,提示Sirt1或許與DPN發(fā)生、發(fā)展及病情轉(zhuǎn)歸有關(guān)[24]。本研究中,與非DPN組比較,DPN組血清Sirt1水平明顯降低,說明Sirt1在DPN中存在異常表達(dá),該蛋白可能參與了DPN發(fā)病過程。此外,Sirt1水平降低為DPN的危險(xiǎn)因素,并與氧化應(yīng)激指標(biāo)和TLR-4、NF-κB水平存在相關(guān)性,推測DPN的發(fā)生可能與Sirt1水平降低導(dǎo)致對TLR-4/NF-κB炎癥通路及氧化應(yīng)激的抑制作用減弱有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為,Sirt1可通過去乙酰化抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷的作用[25],這或許可以解釋上述推測。與此同時(shí),年齡增大、T2DM病程偏長、HbA1c水平升高、DR、HDL水平降低也是DPN的危險(xiǎn)因素,與既往研究結(jié)論一致[26-28],臨床可將血清Sirt1、Sestrin2水平與臨床危險(xiǎn)因子結(jié)合應(yīng)用于DPN早期預(yù)測。

綜上所述,DPN患者血清Sirt1、Sestrin2水平下降,這或許與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)過度激活有關(guān),其有望成為預(yù)測DPN發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的分子標(biāo)志物。在臨床實(shí)踐中,早期檢測T2DM患者血清Sirt1、Sestrin2水平,有助于評(píng)估DPN風(fēng)險(xiǎn)性,制訂個(gè)體化診療方案,改善患者預(yù)后。但Sirt1和Sestrin2之間有無關(guān)聯(lián),還需更多研究加以證實(shí)。