出入庫溫度變化對低溫貯藏紅花種子生活力及耐儲性的影響

陳翠平, 徐紅霞, 董 帥, 文正瑩, 賓良芫, 閆 婕, 裴 瑾

(西南特色中藥資源國家重點實驗室/成都中醫藥大學藥學院, 成都 611137)

中藥種質資源是中藥種業的“芯片”,是新品種選育的物質基礎。中藥種質資源的保護和高效利用可以大力促進中藥的質量提升和推動產業的高質量發展[1]。低溫種子庫貯藏是目前中藥種質資源貯藏的主要方式,低溫種質的安全保存是低溫種子庫最重要的基礎任務。如何延長壽命、維持遺傳完整性和防止生活力意外喪失一直是種質安全保存的研究難點和熱點[2]。種質資源的安全保存受諸多因素的影響,包括貯藏前的種子質量(如種子的成熟度、健康度、生活力等);貯藏方法(如種子貯藏前處理方法、種子出入庫溫度變化情況等);種子貯藏條件(如種子含水量、貯藏溫度等);種子儲藏時間(如種子衰老拐點出現時間、種子生活力喪失時間等)。

低溫種質資源庫按貯藏條件分類,主要有長期庫、中期庫、短期庫及超低溫庫,技術參數分別為溫度-18 ℃、RH<50%,溫度-4 ℃、RH<65%,溫度4～15 ℃、RH<65%,-80 ℃以下條件,通常是液氮的液相(-196 ℃)、霧相(-150 ℃)或超低溫冰箱[3-4]。出入庫溫度變化對種質生活力等指標的影響主要集中在液氮超低溫貯藏,超低溫保存出入庫溫度變化依據保存原理主要有快速和梯度兩種。快速溫度變化主要基于玻璃化原理,在低含水量和低溫條件下,減小細胞內自由水,達到玻璃化狀態,能抑制細胞內有害化學反應的發生[5-6],如快速投入液氮冷凍、40 ℃水浴快速解凍,含水量27.5%的肉豆蔻種子生活力最高,含水量10%的人參裂開種子發芽率、發芽勢、成苗率均最高[7-8];梯度溫度變化即采用逐步降溫方法,可使細胞內水分流到細胞外結冰,降低細胞內水分含量,避免胞內冰晶傷害[9],如使用梯度降溫入庫、40 ℃水浴快速解凍出庫,含水量7%的九里香種子保存效果最佳[10],使用室溫緩慢解凍較42 ℃水浴快遞解凍,馬尾松種子的發芽率更高[11]。目前,未見出入庫溫度變化對長期庫、中期庫、超低溫冰箱貯藏種子的生活力及耐儲性影響的報道。

菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)是一種多用途的經濟作物[12],其花入藥,是常用的活血化瘀中藥;種子及紅花籽油可藥用或油用,含不飽和脂肪酸,營養價值高[13-14]。目前全世界有超過60個國家和地區開展紅花的種植。本研究以正常型紅花種子為研究對象,以生活力、可溶性糖、可溶性蛋白、電導率及酶活性等生理生化指標為檢測指標,探索長期庫、中期庫、超低溫冰箱保存紅花種子時,出入庫溫度變化對種子的生活力及耐儲性的影響,為紅花種子的低溫貯藏篩選適宜的出入庫方法,為正常型種子出入庫保存提供參考。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料

供試材料收購于新疆裕民縣振東道地紅花開發有限公司,經課題組鑒定為菊科植物紅花的種子,含水量為8%、初始發芽率為89.0%。試驗前種子置于陰涼通風處。

1.2 試驗儀器

電導率儀(DDS-11A型,雷磁),酶標儀(FLASH,Thermo),臺式離心機(HITACHI CT15RE,日立),冷凍干燥機(寧波市雙嘉儀器有限公司),0.01 mg感量電子天平(Sartoius,SQP SECURA2250-1CN),IKA研磨機(A11,廣州儀科實驗室技術有限公司),光照培養箱(GTOP系列,浙江托普儀器有限公司)等。

1.3 試劑試藥

植物可溶性糖含量檢測試劑盒、BCA蛋白法含量測試盒、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)等,試劑盒均購于蘇州科銘生物技術有限公司。

2 實驗方法

2.1 樣品制備

2.1.1種子的包裝與貯藏

將紅花種子密封,貯藏于不同溫度下:中期庫(-4±2)℃、長期庫(-18±2)℃和超低溫冰箱(-75±5)℃,凍存1個月后取出,對樣品進行發芽指標、可溶性糖及可溶性蛋白等生理生化指標的測定。

2.1.2出入庫溫度變化情況

參照馬千全等[9]的方法,結合國家中藥種質資源庫的實際情況,設定紅花種子貯藏的出入庫溫度變化條件,如表1。

表1 紅花種子貯藏條件Table 1 Storage conditions of Carthamus tinctorius L.

2.2 發芽和成苗指標的測定

參照GB/T 3543—1995《國家種子檢驗規程》[15]技術規定的發芽方法進行發芽試驗。隨機選取50粒種子,置于鋪有兩層濾紙的培養皿中,放置在光照培養箱中,發芽條件:(25±2)℃,16 h光照,8 h黑暗。4次重復,第7天統計發芽率[16]。計算公式如下:

發芽率/%=(發芽種子粒數/供試種子粒數)×100%;

發芽勢/%=(2 d發芽種子粒數/供試種子粒數)×100%;

發芽指數=∑(Gt/Dt),其中:Gt為t天后的發芽數,Dt為發芽天數;

成苗率/%=(成苗種子粒數/供試種子粒數)×100%。

以根系和葉片發育正常的幼苗為成苗計數標準。

2.3 種子浸出液電導率的測定

電導率參照尹燕枰和董學會[17]的方法測定,隨機稱取凈種子20粒,稱重,用去離子水沖洗2次,定性濾紙吸干浮水,然后放入100 mL錐形瓶中,加入50 mL去離子水,用電導率儀測定初始電導值(d1);20 ℃ 條件下浸泡24 h,測定浸出液電導值(d2);然后連同種子的浸泡液在沸水中煮35～40 min,冷卻至20 ℃后,加去離子水定容至煮沸前的體積,測定煮沸后種子浸出液的絕對電導值(d3),4 次重復。計算公式如下:

相對電導率/%=[(d2-d1)/(d3-d1)]×100%

2.4 種子可溶性糖、可溶性蛋白含量及抗氧化酶系統活性測定

分別按照試劑盒說明書進行操作,測定紅花種子中可溶性糖、可溶性蛋白含量以及SOD、POD、CAT的活性,每個指標檢測重復4次。

2.5 數據分析

使用SPSS20.0軟件分析處理數據,使用Origin軟件作圖。

3 結果與分析

3.1 出入庫溫度變化對紅花種子發芽率的影響

如表2所示,中期庫貯藏紅花種子的發芽率無統計學差異,長期庫、超低溫冰箱貯藏紅花種子發芽率有顯著性差異,在快速降溫入庫和快遞升溫出庫條件下,種子發芽率最高。

表2 不同出入庫溫度變化紅花種子生活力及生理生化指標變化Table 2 Changes of seed viability and physiological and biochemical indexes of Carthamus tinctorius L. with different temperature variation in and out of storage

3.2 出入庫溫度變化對紅花種子相對電導率的影響

如表2所示,貯藏于中期庫和長期庫的紅花種子,各組間的相對電導率變化無明顯差異;貯藏于超低溫的紅花種子,出入庫溫度變化造成種子相對電導率具有顯著性差異,快速降溫入庫和快速升溫出庫種子的相對電導率最低。

3.3 出入庫溫度變化對紅花種子可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

如表2所示,貯藏于中期庫的紅花種子可溶性糖和可溶性蛋白含量無明顯差異;貯藏于長期庫的紅花種子可溶性糖含量無明顯差異,可溶性蛋白含量在入庫時梯度降溫和出庫時梯度升溫含量最高,具有顯著性差異;貯藏于超低溫的紅花種子在入庫時快速降溫、出庫時快速升溫其可溶性糖和可溶性蛋白含量最高。

3.4 出入庫溫度變化對紅花種子抗氧化酶活性的影響

如表2所示,貯藏于中期庫和長期庫的紅花種子,其抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性在各處理條件下無明顯差異。貯藏于超低溫的紅花種子各處理組間則有顯著性差異,SOD活性在入庫時快速降溫和出庫時快速升溫處理下較低,POD和CAT活性則較高,對處于超低溫的紅花種子來說,入庫時快速降溫和出庫時快速升溫方式較為安全。

3.5 不同出入庫溫度對紅花種子各生理指標的影響

SPSS20.0軟件處理不同出入庫溫度變化下,貯藏1個月后紅花種子的10個檢測指標相關系數矩陣,Origin軟件作圖,結果如圖1所示。可見,種子發芽率與發芽勢、發芽指數、POD活性、可溶性蛋白呈顯著正相關,與電導率呈顯著負相關;成苗率與發芽勢呈顯著正相關;可溶性糖與可溶性蛋白、POD活性呈顯著正相關,與SOD活性呈顯著負相關;CAT活性與可溶性蛋白及POD活性呈顯著正相關。

圖1 各監測指標的Pearson相關分析 Fig.1 Pearson correlation of each monitoring index

將不同出入庫溫度變化下,貯藏1個月后紅花種子的10個檢測指標進行PCA分析,結果見圖2。可知,長期庫及中期庫貯藏紅花種子組間差異較小;而超低溫冰箱貯藏紅花種子組間差異極大,其中,入庫時快速降溫及出庫時快速升溫是最適宜紅花種子的出入庫溫度處理方法,在此方法下紅花種子的發芽率、發芽勢、發芽指數、成苗率、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、POD活性、CAT活性最高,相對電導率及SOD活性最低。

圖2 主成分二維圖Fig.2 Principal component two-dimensional diagram

4 討 論

目前長期庫貯藏種子在出入庫時,常采用梯度降溫和梯度升溫的方式,如國家作物種質資源庫、中國西南野生生物種質資源庫、國家中藥種質資源庫使用短期庫(溫度4 ℃、RH<65%)4 ℃或雙十五干燥間(溫度15 ℃、RH=15%)作為緩沖,入庫時將種子置于干燥間干燥后貯藏長期庫、中期庫,出庫時置于短期庫或干燥間放置24 h后取出。

本研究檢測了中期庫(-4±2)℃、長期庫(-18±2)℃及超低溫冰箱(-75±5)℃不同出入庫溫度變化下,紅花種子的生活力指標、耐儲性指標及生理生化指標,結果表明,中期庫貯藏種子各指標無顯著性差異、長期庫貯藏種子的發芽率和可溶性蛋白含量開始出現顯著差異,而超低溫冰箱貯藏種子各指標均出現顯著差異性。可溶性蛋白、可溶性糖含量等細胞內含物能提高植物的脫水耐性,降低過冷卻點,增強玻璃化能力[22],本研究發現,使用速凍速解超低溫保存紅花種子的可溶性糖、可溶性蛋白含量最高,長期庫梯度冷凍和梯度解凍的紅花種子可溶性蛋白含量最高,與其他出入庫方法相比具有顯著性差異。可見,隨著貯藏溫度的降低,種子生活力及耐儲性指標受出入庫溫度變化的影響越大。

超低溫貯藏種子時,不同物種適宜的出入庫溫度變化情況存在較大差異,如肉豆蔻[7]、人參[8]、東北紅豆杉[18]、馬尾松[11]、益智[19]、海南龍血樹[20]等種子適合快速冷凍,夏枯草及皺果莧[21]、樟[22]、九里香[10]、豬屎豆[23]等種子適合梯度或緩慢冷凍,肉豆蔻[7]、人參[8]、海南龍血樹[20]、石香竹[24]、胡楊[25]、韭菜、大蔥、韭蔥及洋蔥[26]等種子適合快速解凍方法,樟[22]、九里香[10]、玉蟬花[27]等種子適合梯度或緩慢解凍。因此,不同物種種子在長期庫、超低溫貯藏時,應當考察出入庫溫度變化對種子生活力的影響。

此外,超低溫保存對部分種子發芽率有“刺激”作用,經超低溫凍存后種子發芽率有所提高,如馬尾松[11]及毛竹[28]等。本研究中除超低溫冰箱使用速凍梯解或梯凍梯解方法外,其他出入庫溫度變化情況下,紅花種子在中期庫、長期庫及超低溫冰箱中保存1個月均有促進紅花種子萌發的作用,發芽率均高于初始發芽率(89%),但具體機制有待進一步研究。