金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉化條件的優化

黃嘉鳳, 但 俊, 黃滿霖, 陳選鵬, 黃海波

(廣州中醫藥大學中藥學院, 廣州 510006)

金毛狗脊[Cibotiumbarometz(L. ) J. Sm.]為蚌殼蕨科(Dicksoniaceae)金毛狗屬(CibotiumKaulf.)多年生大型樹狀陸生蕨類[1],又稱金毛猴、狗青、百枝、金毛狗等,以根狀莖入藥,具有祛風濕、補肝腎、強腰膝等功效,適用于腰背酸痛、風寒濕痹、手足麻木及半身不遂等癥,是重要的藥用植物[2]。金毛狗脊植株具有四季常綠的大型羽狀葉,且根狀莖和葉柄基部密被金色茸毛而狀似伏地的金毛狗,形態獨特,具有較高的經濟開發價值[3-4]。雖然金毛狗脊分布范圍較廣,但由于生存環境破壞嚴重以及人為大量采挖等因素的影響,野生資源量不斷減少,已被列為國家二級保護植物[5]。通過金毛狗脊組織培養的研究,對保護野生資源、擴大該物種的數量,對該物種的開發利用等具有重要意義。

目前,針對金毛狗脊的組織培養研究多集中在金毛狗脊的孢子萌發[6-7]、配子體發育[8-9]和孢子體誘導[10]方面,缺乏對金毛狗脊原葉體增殖和孢子體誘導分化方面的研究。蘇鈺琴[10]研究了6-BA對金毛狗脊孢子體誘導分化的影響;李雪等[6]研究了無機鹽濃度和是否添加KT、NAA和BA對孢子體誘導的影響,但其考察的影響金毛狗脊生長發育的因素還不夠完善,且因素水平設置不夠。因此,設計無機鹽、蔗糖、KT、NAA和6-BA等5因素4水平正交實驗,研究金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉化的最佳培養條件,為金毛狗脊組織培養提供理論依據,以更好地實現金毛狗脊孢子無菌繁殖培養。

1 材料與方法

1.1 孢子的采集

金毛狗脊孢子于2021年4月17日采自廣州花都區梯面鎮西坑村,113°14′15.12″E,23°34′40.76″N,海拔101 m。采集孢子時將背面有成熟孢子囊的羽片剪下,用干凈的報紙包裹并裝于干凈的密封袋中帶回實驗室,于室內通風干燥處放置1 d,輕輕拍打使孢子囊內的孢子充分脫落,取出羽片后把報紙上的孢子先后用60目和200目的金屬篩過篩,得到較為純凈的孢子粉。過篩后的孢子粉收集于50 mL離心管內,密封條密封,放入密封袋中于4 ℃冰箱保存備用。

1.2 孢子的消毒

孢子在接種前進行消毒處理,稱取適量金毛狗孢子,置于2 mL離心管中,先用無菌水潤濕,離心去掉上清液,加入5%次氯酸鈉水溶液,浸泡消毒4 min,離心去上清液,用無菌水清洗3～5次,加入蒸餾水至2 mL搖勻。

1.3 培養基的篩選

采用正交設計考察不同濃度的無機鹽、蔗糖、萘乙酸(NAA)、激動素(KT)和6-芐氨基嘌呤(6-BA)對金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉化的影響,用L16(45)正交表安排實驗,見表1。

表1 金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉化培養基正交設計Table 1 Orthogonal design table of Cibotium barometzprotophyll proliferation and sporophyte transformation medium

1.4 實驗方法

從孢子接種培養60～80 d所得原葉體中,選取生長良好無污染的翠綠色原葉體團在超凈工作臺上,將其剝離開,分割成1 cm3的小原葉體團,每瓶接種5個原葉體團(圖1),16個處理組,每組15瓶。接種30 d后將原葉體團取出稱量每瓶的總鮮重,使用烘箱,于60 ℃烘干6 h,稱量每瓶總干重,得到原葉體增殖后的重量數據[11]。

注:A為接種前;B為接種后;培養瓶直徑6.8 cm。圖1 金毛狗脊原葉體Fig.1 Cibotium barometz protolophylls

圖3 16個處理組金毛狗脊孢子體轉化結果Fig.3 Transformation results of sporophytes in 16 treatment groups

同樣方法,每瓶接種5個原葉體團,16個處理組,每組15瓶。培養80 d后計算孢子體轉化數和孢子體轉化率,得到孢子體轉化數據。以第一片孢子小葉片出現視為孢子體開始轉化,預實驗中發現原葉體接種40～55 d后開始轉化,故原葉體增殖培養以原葉體接種30 d后統計數據,孢子體轉化培養開始轉化30 d后(原葉體接種80 d后)進行孢子體轉化率數據統計。

1.5 數據處理及統計

數據采用Minitab軟件對指標的綜合評分進行極差分析,采用SPSS軟件對原始數據進行非參數檢驗分析。孢子體轉化數為每瓶從5個原葉體團觀測到的小孢子體總數。

孢子體轉化率/%=(原葉體團轉化數/原葉體接種團數)×100%。

2 結果與分析

2.1 不同培養基配比對金毛狗脊原葉體增殖的影響

表2結果表明,無機鹽、蔗糖和NAA濃度對金毛狗脊原葉體增殖有顯著影響,而KT濃度對原葉體增殖無顯著影響,原葉體鮮重表明,6-BA濃度對原葉體增殖影響無顯著差異,從原葉體干重結果可知,6-BA濃度對原葉體增殖存在顯著影響。隨著無機鹽濃度升高,原葉體重量呈先升后降趨勢,最佳無機鹽濃度為1/2MS,在無機鹽為零的13～16處理組中,原葉體生長發育較差,發黃發蔫;隨著蔗糖濃度升高,原葉體重量先增后減,添加2%蔗糖最為適宜。原葉體重量隨著NAA濃度提高呈先增后減又增的趨勢,當NAA濃度為0.1 mg/L時,原葉體增殖結果最佳;原葉體重量隨著6-BA濃度提高呈先減后增又減的趨勢,當6-BA濃度為0.3 mg/L時,原葉體增殖效果最佳。

表2 不同培養基配比對金毛狗脊原葉體增殖的影響Table 2 Effects of different media ratios on the proliferation of protolophylls in Cibotium barometz

由于實驗涉及原葉體鮮重和原葉體干重兩個指標,因此采用排隊評分法[12]對實驗結果進行分析,原葉體重量從小到大排序依次評分1～16分,將每組實驗的兩個指標得分相加即得綜合評分(表3),隨即進行極差分析,分析結果如表4所示。

表3 原葉體增殖排隊評分法結果Table 3 Results of protophyll proliferation queuing scoring method

表4 原葉體增殖排隊評分法極差分析Table 4 Extreme analysis table of protophyll proliferation queuing scoring method

在16組實驗中,Y8組原葉體鮮重、干重和實驗綜合評分最高,條件為1/2MS+3%蔗糖+0.3 mg/L KT+0.1 mg/L NAA,原葉體干重和鮮重分別為1.798 1 g、0.159 1 g。根據極差分析結果(表5),5個因素對金毛狗脊原葉體增殖的影響為:蔗糖(B)>無機鹽(A)>NAA(D)>6-BA(E)>KT(C),最佳培養基配比為B3A2D2E3C2,即1/2MS+2%蔗糖+0.1 mg/L NAA+0.3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。

表5 不同培養基配比對原葉體增殖的影響非參數檢驗Table 5 Nonparametric test of the effect of different media ratios on protophyll proliferation

2.2 不同培養基配比對金毛狗脊孢子體轉化的影響

表6結果表明,無機鹽、KT、NAA和6-BA濃度對金毛狗脊孢子體轉化有顯著影響,而蔗糖濃度對孢子體轉化無顯著影響。隨著無機鹽濃度升高,孢子體轉化數和轉化率均呈先升后降趨勢,1/4MS對于孢子體轉化最適宜,在無機鹽為零的13～16處理組中,原葉體生長發育較差,逐漸發黃并死亡,無法誘導孢子體;隨著NAA濃度提高,孢子體轉化數和孢子體轉化率呈先增后減又增的趨勢,當NAA濃度為0.1 mg/L時,孢子體轉化結果最佳;隨著6-BA濃度提高,孢子體轉化數和孢子體轉化率呈先減后增又減的趨勢,不添加6-BA時,孢子體轉化效果最佳;孢子體轉化數和孢子體轉化率隨著KT濃度的提高呈先減后增的趨勢,當KT濃度為0.5 mg/L時,孢子體轉化結果最佳。

表6 不同培養基配比對孢子體轉化的影響Table 6 Effects of different media ratios on sporophyte transformation

由于實驗指標同樣有兩個:孢子體轉化數和孢子體轉化率,因此采用排隊評分法對實驗結果進行分析,從小到大排序給分,轉化數和轉化率為0的均給1分,其余依次下去,數據相同則取平均,如排名為7的數據有兩組,則評分為7.5分,將每組實驗的兩個指標分數相加即得綜合評分(表7),隨即進行極差分析,分析結果如表8所示。

表7 孢子體轉化排隊評分法結果數據Table 7 Sporophyte transformation queuing scoring method result data

表8 孢子體轉化排隊評分法極差分析Table 8 Extreme analysis table of sporophyte transformation queuing scoring method

表9 不同培養基配比對孢子體轉化的影響非參數檢驗Table 9 Nonparametric test of the effect of different media ratios on sporophyte transformation

在16組實驗中,Y10組孢子體轉化數、轉化率和實驗綜合評分最高,即條件為1/4MS+1%蔗糖+0.5 mg/L KT+0.3 mg/L NAA,孢子體轉化數和轉化率分別為61.44和100%。Y6組孢子體轉化率雖然也達到100%,但孢子體轉化數僅為37.78,僅為Y10組(61.44)的50%,故Y6組劣于Y10組。根據極差分析(表8),5個因素對金毛狗脊孢子體轉化的影響為:無機鹽(A)>蔗糖(B)>KT(C)>6-BA(E)>NAA(D),最佳培養基配比為A3B2C4E1D2,即1/4MS+1%蔗糖+0.5 mg/L KT+0.1 mg/L NAA。

圖2 16個處理組金毛狗脊原葉體增殖結果 Fig.2 Proliferation results of protolophylls of Cibotium barometz in 16 treatment groups

3 結論與討論

培養基中無機鹽濃度對金毛狗脊原葉體的生長發育和孢子體轉化都有顯著影響。本研究表明,金毛狗脊原葉體增殖宜采用1/2MS,孢子體轉化宜采用1/4MS。在無機鹽為零的處理組中,原葉體生長發育較差,逐漸發黃并死亡,無法誘導孢子體,不能正常生長發育,這說明在金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉化過程中,無機鹽是必不可少的成分,且低濃度的無機鹽更適宜于金毛狗脊原葉體的生長發育。李雪等[6]認為,低鹽離子濃度有利于金毛狗脊孢子體的誘導,1/10 MS孢子體誘導相對最高。本實驗結果與之有一定差異,原因有待進一步驗證。

蔗糖可為蕨類植物的生長發育提供碳源,同時調節培養基中的滲透壓。在蔗糖對金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉化影響的研究中發現,蔗糖對金毛狗脊的原葉體增殖影響較大,但對金毛狗脊的孢子體轉化無明顯影響,在一定范圍內,較高的蔗糖含量更有利于金毛狗脊的原葉體增殖,而金毛狗脊孢子體轉化對蔗糖的需求不高,因此培養中可不添加或少量添加蔗糖。吳華等[13]對扇葉鐵線蕨(AdiantumflabellulatumL.)的研究表明,蔗糖有利于分生區的發育和性器官的分化,本實驗結果與之一致;而在孢子體轉化上結果不同,蔗糖對金毛狗脊孢子體轉化影響不顯著,原因可能為蕨類植物之間存在一定差異,金毛狗脊孢子體轉化相較扇葉鐵線蕨對蔗糖的需求更少。

本研究表明,NAA和6-BA對金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉化均有顯著影響。添加低濃度NAA(0.1 mg/L),有利于金毛狗脊原葉體增殖和孢子體轉化,且生根也較多,可以達到孢子體誘導的目的;與王益和[14]的實驗結果一致。添加低濃度6-BA(0.3 mg/L),有利于金毛狗脊原葉體增殖;不添加6-BA對孢子體轉化更適宜。蘇鈺琴[10]在原葉體接種25 d后統計金毛狗脊孢子體分化率,發現隨著6-BA濃度的增加,孢子體分化率提高,原葉體變得緊實,當6-BA濃度達1.5 mg/L時,分化率最高,再加大6-BA的濃度,分化率降低。本實驗結果與其不一致,原因可能是原葉體初始大小和培養天數的不同,導致所得到的孢子體轉化率不一致;另外,6-BA濃度設置的不同,金毛狗脊的孢子體轉化可能需要較高濃度的6-BA,有待進一步的驗證。KT對金毛狗脊的孢子體轉化有利,隨著KT濃度的提高,孢子體轉化數和孢子體轉化率呈先減后增的趨勢,原因可能為金毛狗脊生長所需KT濃度較高,不在實驗濃度范圍內,有待進一步研究。李雪等[6]實驗顯示,KT(0.1 mg/L)有利于金毛狗孢子體誘導;孫曉丹[15]對桂皮紫萁(OsmundacinnamomeaL. var. Asiatica)的研究中顯示,一定濃度的KT有利于桂皮紫萁原葉體增殖和孢子體轉化。因此,金毛狗脊原葉體增殖需要低濃度的NAA和6-BA,對KT無明顯需求;孢子體轉化培養同樣需要低濃度的NAA和6-BA,KT或需要更高濃度。