瑞芬太尼通過上調(diào)lncRNA DGCR5表達影響卵巢癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的機制研究

邱衛(wèi)華, 郭晴晴, 羅建喜

(1. 湖北省武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院 麻醉科, 湖北 武漢, 430400;2. 湖北省武漢市第四醫(yī)院 疼痛科, 湖北 武漢, 430033)

在所有婦科癌癥中,惡性卵巢腫瘤的致死率最高[1]。晚期卵巢癌的一線化療藥物是順鉑,但耐藥性會導致順鉑和許多其他化療藥物的有效性顯著降低[2]。瑞芬太尼是一種作用于阿片類藥物受體的合成阿片類藥物,具有起效和抵消時間短的特點[3]。瑞芬太尼在全身麻醉和鎮(zhèn)靜期間廣泛用作輔助鎮(zhèn)痛藥[4]。既往研究[5]報告了瑞芬太尼對腫瘤細胞的作用,例如瑞芬太尼以劑量依賴的方式減輕肺癌A549細胞增殖,加速其凋亡。瑞芬太尼可抑制胃癌細胞的生長,機制與上調(diào)微小RNA-206(miRNA-206)靶向高爾基磷蛋白3(GOLPH3)有關(guān)[6]。但是,瑞芬太尼對卵巢癌細胞惡性生物行為的影響與機制尚未見報道。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄物,無蛋白質(zhì)編碼能力[7-8], 被確定為癌癥生物學的關(guān)鍵參與者[9]。lncRNA DiGeorge綜合征關(guān)鍵區(qū)域基因5(DGCR5)與多種類型的癌癥有關(guān),在卵巢癌中表達下調(diào),其低表達與卵巢癌患者的腫瘤直徑大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多、臨床分期晚和總生存期短有關(guān),可能是預測卵巢癌患者臨床進展和預后的新的生物標記物[10]。異丙酚通過提高lncRNA DGCR5對肝癌細胞發(fā)揮抗癌活性[11]。然而, lncRNA DGCR5是否介導瑞芬太尼調(diào)節(jié)卵巢癌細胞功能的過程尚不清楚。本研究探討瑞芬太尼對卵巢癌細胞SKOV3、OVCAR3細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響,通過分析lncRNA DGCR5的表達來研究瑞芬太尼影響卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

卵巢癌細胞SKOV3、OVCAR3(美國典藏培養(yǎng)物保存中心),瑞芬太尼(宜昌人福藥業(yè)),小干擾RNA(siRNA)陰性對照(si-NC)、lncRNA DGCR5 siRNA(si-lncRNA DGCR5)(上海Gene Pharma), 細胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8, 目錄號KGA317)、蛋白酶抑制劑(目錄號KGP603)、磷酸酶抑制劑(KGP602)、全細胞裂解測定緩沖液(KGP250)(江蘇KeyGen BioTECH), 8 μm Transwell 小室(目錄351158, 美國Corning), PrimeScript RT試劑盒(日本TaKaRa), Taq qPCR Master Mix(美國Promega)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組處理: 將SKOV3、OVCAR3細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。分別將細胞SKOV3、OVCAR3分為0、0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼組、si-NC組、si-lncRNA DGCR5組、si-NC+500 ng/mL瑞芬太尼組、si-lncRNA DGCR5+500 ng/mL瑞芬太尼組。其中,不同濃度瑞芬太尼組以終濃度為0、0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼[12]的培養(yǎng)基分別作用于細胞SKOV3、OVCAR3 48 h。lncRNA DGCR5低表達時,根據(jù)商購Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑的操作說明,在融合率為60%～70%的SKOV3、OVCAR3細胞中分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-lncRNA DGCR5(5′-GACATCACACAAATATGCAAGAGAA-3′), 5～6 h后,轉(zhuǎn)染基質(zhì)替換為新鮮培養(yǎng)基或終濃度為500 ng/mL瑞芬太尼的培養(yǎng)基,并保持48 h。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖: 根據(jù)制造商的說明,將2×104個卵巢癌SKOV3、OVCAR3細胞接種在裝有100 μL培養(yǎng)基的96孔板中, 24 h后參照1.2.1標題中的分組,與終濃度為0、0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼的培養(yǎng)基或終濃度為75.0 μmol/L順鉑(陽性對照)的培養(yǎng)基一起培養(yǎng),或進行細胞轉(zhuǎn)染。48 h后,與CCK-8試劑孵育2 h后,使用BioTek酶標儀在450 nm處測量吸光度(A)值(A450)來評估2種細胞的增殖活性。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡: 收集SKOV3、OVCAR3細胞,在黑暗中于37 ℃孵育膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC和碘化丙啶(PI), 孵育15 min, 通過Becton-Dickinson流式細胞儀定量凋亡細胞。

1.2.4 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲: 為了進行2種細胞遷移和侵襲分析,將不含血清的150 μL RPMI-1640培養(yǎng)基中的1×105個卵巢癌SKOV3、OVCAR3細胞分別培養(yǎng)于24孔板上的8 μm Transwell上部隔室中,上部隔室?guī)в谢|(zhì)膠(侵襲)或不帶有基質(zhì)膠(遷移)。誘導2種細胞通過膜主動侵襲或遷移到含有10%胎牛血清的600 μL RPMI-1640培養(yǎng)基的下部隔室中。37 ℃孵育48 h后,輕輕去除殘留在Transwell上部的細胞。固定后使用結(jié)晶紫將附著在膜下表面的SKOV3、OVCAR3細胞染色。在倒置顯微鏡下以200倍放大率拍攝侵襲或遷移的細胞,并在5個隨機選擇的區(qū)域中計算侵襲或遷移細胞的數(shù)量。

1.2.5 免疫印跡試驗(Western blot)檢測蛋白表達: 來自2種細胞的總蛋白在含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的全細胞裂解測定緩沖液中裂解。通過Bio-Rad蛋白質(zhì)測定試劑盒檢測蛋白濃度。將每個樣品30 μg蛋白溶解在10% SDS-PAGE凝膠上,電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下,用脫脂奶粉在緩沖液中封閉PVDF膜60 min, 并在4 ℃與下述一抗孵育過夜: 細胞周期蛋白D1(CyclinD1)兔多克隆抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2兔多克隆抗體、MMP9兔多克隆抗體(1∶1 000, 美國Proteintech), 活化的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)兔多克隆抗體(1∶500, 美國abcam)。與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗溫育60 min, 使用ECL試劑檢測免疫反應蛋白,并通過Syngene Bio Imaging進行可視化。以β-肌動蛋白(β-Actin)為對照,使用Quantity One軟件定量蛋白水平。

1.2.6 RNA提取和定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測lncRNA DGCR5表達[9]: 按照Invitrogen制造商的說明,使用TRIzol試劑從SKOV3、OVCAR3細胞中提取總RNA, NanoDrop 2000c分光光度計測量提取的RNA的濃度。確定提取的RNA僅在A260/A280比率為1.8～2.1時使用。此后,將RNA儲存在-80 ℃進行進一步實驗。在PrimeScript RT試劑盒的標準規(guī)程下,使用隨機引物將總RNA(1 μg)反轉(zhuǎn)錄為互補DNA。在下述PCR條件下,通過ABI Prism 7300序列檢測系統(tǒng)在Taq qPCR Master Mix上進行qRT-PCR反應擴增lncRNA DGCR5: 95 ℃ 20 min, 95 ℃ 10 s, 隨后進行40個循環(huán),分別為98 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s。lncRNA DGCR5和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的引物如下: lncRNA DGCR5正向引物為5′-CCAAGCCTGTCTGTGTGTGTGTTC-3′,反向引物為5′-GGGAGACACAGACCACAAGA-3′;GAPDH正向引物為5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′, 反向引物為5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′。lncRNA DGCR5的相對表達通過2-△△Ct公式計算,被標準化為內(nèi)源基因GAPDH。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計與分析,結(jié)果表示為平均值±標準差。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.01定義為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細胞增殖的抑制作用

CCK-8法結(jié)果顯示,與0 ng/mL瑞芬太尼組比較, 0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼組或順鉑作用于卵巢癌細胞SKOV3、OVCAR3后,細胞的增殖活性依次降低,并以500.0 ng/mL瑞芬太尼組增殖活性最低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

與0 ng/mL瑞芬太尼比較, **P<0.01。圖1 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細胞增殖的抑制作用(n=9)

2.2 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細胞凋亡的誘導作用

流式細胞儀結(jié)果顯示,與0 ng/mL瑞芬太尼組比較, 0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼組作用于卵巢癌細胞SKOV3、OVCAR3后,細胞的凋亡率依次增加,且SKOV3、OVCAR3細胞的凋亡率均以500 ng/mL瑞芬太尼組最高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

A: SKOV3細胞凋亡的流式細胞圖; B: OVCAR3細胞凋亡的流式細胞圖; C: SKOV3、OVCAR3細胞凋亡率的柱狀圖。與0 ng/mL瑞芬太尼比較, **P<0.01。圖2 流式細胞術(shù)檢測不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細胞凋亡的誘導作用(n=9)

2.3 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細胞遷移和侵襲的抑制作用

Transwell法結(jié)果顯示,與0 ng/mL瑞芬太尼組比較, 0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼組卵巢癌細胞SKOV3、OVCAR3的遷移和侵襲數(shù)量依次減少,且遷移和侵襲數(shù)量均以500 ng/mL瑞芬太尼最少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖3。

A: SKOV3、OVCAR3細胞遷移情況; B: SKOV3、OVCAR3細胞侵襲情況。與0 ng/mL瑞芬太尼比較, **P<0.01。圖3 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細胞遷移和侵襲的抑制作用(n=9)

2.4 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9的影響

Western blot結(jié)果顯示, 0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼組卵巢癌細胞SKOV3、OVCAR3中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平均比0 ng/mL瑞芬太尼組低, Cleaved-caspase-3蛋白表達水平均比0 ng/mL瑞芬太尼組高,其中SKOV3、OVCAR3細胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達以500 ng/mL瑞芬太尼組最低,而Cleaved-caspase-3蛋白表達則以500 ng/mL瑞芬太尼組最高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖4。

A: Western blot檢測SKOV3細胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白的表達; B: Western blot檢測OVCAR3細胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白的表達。與0 ng/mL瑞芬太尼比較, **P<0.01。圖4 Western blot檢測不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細胞蛋白表達的影響(n=9)

2.5 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細胞中l(wèi)ncRNADGCR5表達的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示, 0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼組卵巢癌細胞SKOV3中l(wèi)ncRNA DGCR5表達水平依次為(1.54±0.07)、(1.98±0.13)、(2.34±0.18)、(2.71±0.24), OVCAR3中依次為(1.32±0.09)、(1.72±0.14)、(2.07±0.13)、(2.49±0.20), 高于0 ng/mL瑞芬太尼組卵巢癌細胞SKOV3中l(wèi)ncRNA DGCR5表達水平(1.00±0.06)和OVCAR3中(1.00±0.08), 并以500 ng/mL瑞芬太尼組lncRNA DGCR5表達水平最高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖5。

與0 ng/mL瑞芬太尼比較, **P<0.01。圖5 不同濃度瑞芬太尼對卵巢癌細胞lncRNA DGCR5表達的影響(n=9)

2.6 lncRNA DGCR5低表達可逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對卵巢癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響

si-lncRNA DGCR5組卵巢癌細胞SKOV3和OVCAR3的lncRNA DGCR5表達水平、凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達水平低于si-NC組,細胞增殖活性、遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平高于si-NC組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。si-lncRNA DGCR5+500 ng/mL瑞芬太尼組卵巢癌細胞SKOV3和OVCAR3的lncRNA DGCR5表達水平、凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達水平低于si-NC+500 ng/mL瑞芬太尼組,細胞增殖活性、遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平高于si-NC+500 ng/mL瑞芬太尼組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖6、圖7、圖8。

3 討 論

SKOV3和OVCAR3是研究細胞行為時常用的卵巢癌細胞[13]。瑞芬太尼是一種短效的阿片受體激動劑,可被血漿和組織中的非特異性酯酶迅速水解[14]。瑞芬太尼具有抑制破骨細胞分化和成熟并降低骨吸收[15],改善心肌[16]、肝臟[17]和腦缺血再灌注損傷[18],減輕炎癥[19]等藥理活性。近年來,瑞芬太尼在腫瘤方面的潛在作用引起了人們的極大關(guān)注。研究[20]報道,瑞芬太尼在胃癌中顯示出抗腫瘤活性,可通過上調(diào)miR-519d-3p靶向STAT3, 抑制胃癌細胞增殖和促進其凋亡。在骨肉瘤MG63細胞中,瑞芬太尼促進miR-148a表達來減少細胞增殖和加速細胞凋亡,這與Cyclin D1的下調(diào)相符[21]。在結(jié)腸癌[22]和胰腺癌[23]細胞中,瑞芬太尼同樣顯示出抗增殖和促凋亡的功能。本研究結(jié)果與此相符,0.5、5.0、50.0、500.0 ng/mL瑞芬太尼減少卵巢癌SKOV3、OVCAR3細胞的增殖活性,并增加2種細胞的凋亡率。另外,瑞芬太尼還可降低卵巢癌SKOV3、OVCAR3細胞的遷移和侵襲活性,這與既往研究吻合。吳遠波等[24]證實2、4、6 ng/mL瑞芬太尼使肺腺癌細胞遷移和侵襲能力顯著下降,周成茂[25]證明瑞芬太尼和Ly294002聯(lián)用可使肝癌細胞遷移能力明顯減弱。上述結(jié)果說明,瑞芬太尼可以抑制卵巢癌細胞的惡性生物學行為,可能成為潛在的卵巢癌抑制劑。

A: SKOV3細胞凋亡的流式細胞圖; B: OVCAR3細胞凋亡的流式細胞圖; C: SKOV3、OVCAR3細胞凋亡率的柱狀圖。與si-NC比較, **P<0.01; 與si-NC+500 ng/mL瑞芬太尼比較, ##P<0.01。圖6 lncRNA DGCR5低表達可逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對卵巢癌細胞凋亡的影響(n=9)

A: SKOV3、OVCAR3細胞遷移情況; B: SKOV3、OVCAR3細胞侵襲情況。與si-NC比較, **P<0.01; 與si-NC+500 ng/mL瑞芬太尼比較, ##P<0.01。圖7 lncRNA DGCR5低表達可逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對卵巢癌細胞遷移及侵襲的影響(n=9)

A: Western blot檢測SKOV3細胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白的表達; B: Western blot檢測OVCAR3細胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白的表達。與si-NC比較, **P<0.01; 與si-NC+500 ng/mL瑞芬太尼比較, ##P<0.01。圖8 lncRNA DGCR5低表達可逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對卵巢癌細胞蛋白表達的影響(n=9)

lncRNA DGCR5也稱為Linc00037,位于人類染色體22q11.21上[10]。lncRNA DGCR5在不同類型的癌癥中具有相反的功能,在某些類型的癌癥(包括肺腺癌[26]和食管鱗狀細胞癌[27])中起到癌基因的作用,但在其他類型的癌癥中發(fā)揮抑癌作用。在甲狀腺乳頭狀癌中, lncRNA DGCR5通過海綿化miR-2861抑制腫瘤細胞的生長和侵襲[28]。在大腸癌中, lncRNA DGCR5通過下調(diào)miR-21抑制RKO和CR4細胞的增殖[29]。在非小細胞肺癌中, lncRNA DGCR5的過表達通過調(diào)節(jié)miR-211-5p/EPHB6軸來抑制細胞生長和轉(zhuǎn)移[30]。卵巢癌組織中l(wèi)ncRNA DGCR5表達下調(diào),并與晚期腫瘤進展密切相關(guān)[10]。本研究中, lncRNA DGCR5低表達降低了卵巢癌細胞SKOV3和OVCAR3的體外凋亡,并提高其增殖、遷移、侵襲能力,這揭示了lncRNA DGCR5在卵巢癌中起抑癌作用。

一些lncRNA可能充當阿片樣物質(zhì)獨特生物學功能的調(diào)節(jié)劑,涉及阿片樣物質(zhì)信號傳遞的lncRNA也可能對藥物行為和功效產(chǎn)生深遠影響[31]。例如,lncRNA MEG3參與阿片類藥物嗎啡介導的小鼠海馬神經(jīng)元HT22細胞自噬[32]。阿片類藥物芬太尼通過MALAT1下調(diào)發(fā)揮保護作用,并在體外和遭受心肌缺血再灌注的小鼠中負調(diào)節(jié)miR-145-5p/BNIP3途徑[33]。本研究檢測到卵巢癌SKOV3、OVCAR3細胞內(nèi)lncRNA DGCR5表達被瑞芬太尼上調(diào),而lncRNA DGCR5低表達可以逆轉(zhuǎn)瑞芬太尼對SKOV3、OVCAR3細胞惡性行為的抑制作用,提示lncRNA DGCR5的上調(diào)是瑞芬太尼發(fā)揮抗卵巢癌作用的重要分子途徑之一。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)瑞芬太尼上調(diào)了卵巢癌細胞SKOV3、OVCAR3中l(wèi)ncRNA DGCR5的表達,并確定了瑞芬太尼抗卵巢癌進展的作用機制。