基于唾液酸化相關長鏈非編碼RNA構建卵巢癌預后模型的研究

胡超揚, 曹曉華, 劉格良, 2, 李 淵, 2, 齊榮暄, 2,張 豪, 于 琦, 2, 孫 焱

(1. 山西醫科大學管理學院, 山西 太原, 030600;2. 山西省臨床決策研究大數據重點實驗室, 山西 太原, 030600)

卵巢癌(OC)是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一[1], 病死率居女性生殖系統惡性腫瘤之首[2], 嚴重威脅女性的生命健康[3]。近年來,隨著轉錄組和計算機技術的發展,長鏈非編碼RNA(lncRNA)作為癌基因或腫瘤抑制因子在癌癥發生及發展中的作用被逐步揭示[4]。有學者[5-7]從銅死亡相關lncRNA、缺氧相關lncRNA、甲基化與免疫相關lncRNA等角度構建了OC預后模型。研究[8]表明,唾液酸化相關lncRNA與許多癌癥病理情況相關,例如ST8 α-N-乙酰神經酰胺α-2, 8-酰基轉移酶6反義1(ST8SIA6-AS1)過表達時, OC患者的總體生存率(OS)顯著下降,加速乳腺癌、肺癌、胰腺癌等細胞周期進程,促進增殖并抑制化療誘導的細胞凋亡; lncRNA母系表達基因3(MEG3)高表達時,腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著增強[9]。

一直以來,以鉑類藥物為基礎的治療方式在OC中表現出原發性耐藥,其化療反應率僅為11%～56%, 患者5年生存率約為60%[10], 需要在新型抗癌藥物方面取得突破。近年來,免疫療法以其高效性、持久性、個體化、毒副作用小等優勢,在惡性腫瘤治療中顯現出良好效果[11]。本研究基于唾液酸化相關lncRNA構建OC預后模型,分析OC患者預后的免疫反應和抗癌藥物敏感性,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 數據獲取

從MSigDB數據庫(http://www.gsea-msigdb.org)獲取19個唾液酸化基因集數據,見表1。從癌癥基因圖譜(TCGA)數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov)獲取420個OC樣本的基因表達數據(其中已包含研究所需的唾液酸化基因表達數據與lncRNA表達數據)及臨床數據。

表1 唾液酸化基因列表

1.2 篩選OC唾液酸化相關lncRNA

采用R包"stat(4.2.1)"對lncRNA和唾液酸化基因進行Pearson相關性分析,以r>0.4且P<0.001為篩選閾值。采用R包"ggalluvial(0.12.3)"與"ggplot2(3.4.0)"對獲得的唾液酸化基因與lncRNA的共表達數據進行可視化展示。

1.3 篩選OC生存相關唾液酸化lncRNA

將OC唾液酸化相關的lncRNA表達數據與OC生存數據進行合并,以1∶1的比例隨機分為訓練組(n=210)和驗證組(n=210),采用卡方檢驗評價訓練組與驗證組臨床特征的差異,以P>0.05為篩選閾值。訓練組采用單因素Cox回歸與Lasso回歸的10倍交叉驗證明確預后顯著的唾液酸化lncRNA, 以P<0.05為篩選閾值。對獲取的預后唾液酸化lncRNA進行偏似然比算法與向前逐步回歸的多因素Cox分析(以進入P=0.05、除去P=0.10為閾值),篩選卵巢癌生存相關的唾液酸化lncRNA(OCSS lncRNA)。驗證組則驗證OCSS lncRNA的準確性。

1.4 OC預后模型構建與驗證

基于OCSS lncRNA構建預后模型,計算每例OC患者的風險評分。風險評分=Coef(i)×Expr(i), 公式中的Coef(i)代表回歸系數, Expr(i)代表lncRNA的表達水平。將訓練組風險評分中位數作為分界點,把涵蓋OC的樣本分為高、低風險組,并繪制風險評分圖、患者生存狀態散點圖與基因表達熱圖。采用R包"survival(3.4.0)"分析總數據集、訓練組和驗證組OC患者高、低風險OS的差異,以及總數據集高、低風險組無進展生存期OS的差異。采用R包"timeROC(0.4)"繪制受試者工作特征(ROC)曲線,用于驗證模型效能。

1.5 OC預后模型臨床價值分析

采用單因素和多因素Cox回歸分析篩選OC的獨立預后因素。基于風險評分與臨床特征數據,采用R包"rms(6.3.0)" "nomogramEx(1.0)" "regplot(1.1)"繪制預測OC患者OS的列線圖,并構建校正曲線驗證列線圖準確性。

1.6 免疫細胞浸潤與免疫治療分析

采用"CIBERSORT"算法分析不同風險人群22種免疫細胞含量的差異,在腫瘤免疫功能障礙和排斥(TIDE)網站檢索OC的TIDE數據(http://tide.dfci.harvard.edu), 分析不同風險人群對免疫治療敏感性的差異,以P<0.05為篩選閾值。

1.7 藥物敏感性分析

從癌癥藥物敏感性基因組學(CDSG)數據庫(https://www.cancerrxgene.org)獲取治療OC的潛在藥物數據,計算藥物的半數有效抑制濃度(IC50),并分析不同風險人群的藥物敏感性差異,以P<0.01為篩選閾值。本研究采用的R軟件版本是4.2.1。

2 結 果

2.1 OC唾液酸化相關lncRNA

通過Pearson相關性分析獲得了1 568個OC唾液酸化相關lncRNA, 見圖1。

圖1 卵巢癌唾液酸化相關lncRNA

2.2 OC預后模型構建

分組臨床統計結果顯示,總數據集、訓練組和驗證組的OC患者在年齡、腫瘤分級和腫瘤分期方面比較,差異無統計學意義(P>0.05), 見表2?；谟柧毥M的單因素Cox與Lasso回歸的10倍交叉驗證分析篩選出21個預后顯著的OC唾液酸化lncRNA,見圖2。通過偏似然比算法與向前逐步回歸的多因素Cox分析最終確定7個OCSS lncRNA納入預后模型,見表3。風險評分=(-0.437×AC015 802.4)+(0.070×AC008 982.2)+(0.063×AC125 807.2)+(-0.704×AC002 306.1)+(0.236×PTPRD-AS1)+(0.111×AC010 834.3)+(-0.293×AL590 133.1)。

表2 訓練組與驗證組臨床資料比較[n(%)]

表3 多因素Cox回歸納入模型的OCSS lncRNA

2.3 OC預后模型效能檢驗

總數據集、訓練組與驗證組的風險評分圖與患者生存狀態散點圖顯示,高風險組的風險值較高,并且隨著風險值的升高,患者的生存時間縮短,死亡例數增加; 總數據集、訓練組與驗證組的基因表達熱圖顯示, 7個OCSS lncRNA在高、低風險組中的表達情況一致。見圖3。Kaplan-Meier(K-M)生存曲線顯示,高風險較低風險患者的OS下降,差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01), 見圖4。此外,預后模型1、3、5年的ROC曲線與不同臨床特征比較的ROC曲線顯示,模型預測患者OS具有較高的準確性,見圖5。

A: 單因素COX篩選的預后顯著的唾液酸化lncRNA, 圖中綠色表示保護因素,紅色表示危險因素; B: Lasso回歸中的Coef系數剖面圖; C: Lasso回歸中調整參數進行10倍交叉驗證(2條虛線之間的區域表示合理值)。圖2 卵巢癌預后顯著的唾液酸化lncRNA

2.4 OC預后模型的臨床價值

本研究納入年齡、腫瘤分級、腫瘤分期、風險評分為協變量,構建Cox比例風險模型,評估上述臨床特征預測預后的潛力。單因素Cox回歸分析顯示,年齡的大小、腫瘤分期的早晚和風險評分的高低是影響OC患者OS的危險因素(P<0.05); 多因素Cox回歸分析顯示,年齡的大小和風險評分的高低是影響OC患者OS的危險因素(P<0.05)。見圖6。因此,年齡和風險評分是影響OC患者OS的獨立預后因素。列線圖可以對OC患者1、3、5年的OS進行預測,校正曲線顯示預測結果與患者實際結果的重合度較好,見圖7。

2.5 免疫細胞浸潤與免疫治療分析

考慮到免疫浸潤在免疫治療中的作用,本研究比較了高、低風險組中的免疫細胞浸潤差異,結果顯示,高風險組的γδT細胞和M1巨噬細胞含量高于低風險組(P<0.05或P<0.01); 免疫治療敏感性分析結果顯示,高風險組的TIDE評分總體高于低風險組(P<0.05)。見圖8。

2.6 藥物敏感性分析

為探尋治療OC的潛在藥物,本研究比較了高、低風險組的藥物敏感性差異,共獲得藥物9種(ERK_2440、ERK_6604、GSK269962A、PD0325901、SCH772984、VX-11e、Selumetinib、Staurosporine、Ulixertinib), 且高風險組的IC50值均低于低風險組,差異有統計學意義(P<0.05),說明上述藥物可能對高風險OC患者具有較高的治療價值。見圖9。

3 討 論

唾液酸化是一種翻譯后修飾,由唾液酸轉移酶、轉運蛋白和神經氨酸酶家族控制的生物學過程[12]。這一過程與許多病理情況有關,例如癌癥、胚胎致死和免疫系統異常[13]。研究[14]表明,唾液酸化相關lncRNA不但可以調節癌細胞的增殖、分化,還可調節癌細胞的代謝重編程,在癌細胞的侵襲和轉移中有至關重要的作用。有學者[15]從唾液酸化相關lncRNA角度構建了結直腸癌預后模型。由于化療藥物的耐藥性,探索新型免疫治療方式與開發新型抗癌藥物一直是研究者關注的焦點。本研究基于唾液酸化相關lncRNA構建OC預后模型,并進一步分析患者預后免疫反應與藥物敏感性,以期為OC患者的精準醫療以及免疫與藥物治療提供依據。

A～C: 總數據集、訓練組與驗證組的風險評分圖; D～F: 總數據集、訓練組與驗證組的患者生存狀態散點圖; G～I: 7個OCSS lncRNA在總數據集、訓練組與驗證組中的基因表達情況。圖3 總數據集、訓練組與驗證組的風險評分圖、患者生存狀態散點圖及基因表達熱圖

A: 總數據集的K-M生存曲線; B: 訓練組的K-M生存曲線; C: 驗證組的K-M生存曲線; D: 總數據集無進展生存期的K-M生存曲線。圖4 總數據集、訓練組、驗證組的K-M生存曲線

A: 預后模型的ROC曲線; B: 預后模型與不同臨床特征比較的ROC曲線。圖5 預后模型的ROC曲線

A: 單因素Cox回歸的獨立預后分析; B: 多因素Cox回歸的獨立預后分析。圖6 不同臨床特征的獨立預后分析

A: 列線圖; B: 列線圖的校正曲線。圖7 預后模型的列線圖與校正曲線

A: 高、低風險組的免疫細胞浸潤分析結果; B: 高、低風險組的免疫治療敏感性分析結果。圖8 高、低風險組的免疫細胞浸潤與免疫治療敏感性

本研究通過分析獲取了1 568個與OC唾液酸化相關的lncRNA, 再通過單因素Cox、Lasso和多因素Cox回歸分析最終確定了7個OCSS lncRNA, 并基于此構建了OC預后模型(AC015802.4、AC008982.2、AC125807.2、AC002306.1、PTPRD-AS1、AC010834.3與AL590133.1)。單因素和多因素Cox回歸分析顯示,年齡和風險評分是OC患者高危的獨立預后因素。列線圖可以較為準確地預測OC患者各階段的OS。

7個OCSS lncRNA中,已有2個被報道與OC密切相關。AC008982.2被認為是一種新型致癌基因,可以促進OC細胞增殖、遷移,與OC患者OS密切相關,并可能作為OC的新型治療靶點[16]。以PTPRD-AS1構建的預后模型不僅可以預測OC患者預后,還與多囊卵巢綜合征顯著相關[17]。剩余的5個OCSS lncRNA未見與OC相關的報道。然而,研究[18]發現AC002306.1的低表達與前列腺癌患者的預后惡化顯著相關, AC015802.4是預測膀胱癌患者OS的關鍵lncRNA。此外, AC125807.2被證實是肺腺癌預后模型的重要成員[19],其在肺腺癌細胞中呈高表達,這種高表達與肺腺癌的不良預后密切相關,當下調AC125807.2表達時,肺腺癌的進展被抑制[20]。因此,進一步研究上述lncRNA在OC中的作用,可以作為對OC認識的一個新維度,可能有助于預測OC患者的預后。

A: ERK_6604敏感性; B: GSK269962A敏感性; C: ERK_2440敏感性; D: Selumetinib敏感性; E: SCH772984敏感性; F: PD0325901敏感性; G: VX-11e敏感性; H: Ulixertinib敏感性; I: Staurosporine敏感性。圖9 高、低風險組的藥物敏感性

本研究對OC低風險和高風險人群的免疫細胞浸潤進行分析,結果顯示γδT細胞和M1巨噬細胞的含量在低風險組較高。γδT細胞具有識別熱休克蛋白和超級抗原的重要功能,是人體抵御病原體的首道防線[21]。研究[22]證實, γδT細胞浸潤到腫瘤中與OC患者OS增加有關,促進γδT細胞反應可能是OC的治療選擇。巨噬細胞的主要免疫系統功能依賴于其吞噬功能,即在感染環境中吞噬各種細胞底物的過程[23]。M1巨噬細胞表現為促炎、抗感染狀態,是一種激活的抗腫瘤狀態[24]。研究[25]表明, M1巨噬細胞通過誘導型一氧化氮合酶優先產生一氧化氮,一氧化氮是一種自由基氣體,對癌細胞和各種病原體都有直接的細胞毒性。結合本研究結果,抑制γδT細胞和M1巨噬細胞反應可能是引起OC進展的因素之一。本研究使用TIDE評分分析患者的免疫治療敏感性,高風險組TIDE評分顯著高于低風險組,提示存在高免疫逃逸傾向,表明高風險組患者不太可能從免疫治療中獲益。

本研究通過比較高、低風險組的藥物敏感性差異,獲得了9種對高風險OC患者具有較高治療價值的藥物(ERK_2440、ERK_6604、GSK269962A、PD0325901、SCH772984、VX-11e、Selumetinib、Staurosporine、Ulixertinib), 上述藥物大多具有抑制細胞外信號調節激酶1/2(ERK1/2)活性或阻斷ERK1/2信號轉導通路的作用[26-29]。ERK1/2是一種參與ERK信號轉導級聯的絲氨酸/蘇氨酸激酶,其活化后進入OC細胞核作用于各種轉錄因子,調節相關基因的轉錄,進而影響OC細胞的生長發育及增殖分化[30]。研究[31]表明,高表達的唾液酸化基因ST6Gal1可通過ERK1/2信號轉導通路,增強OC細胞凋亡抗性,促進OC細胞在富含腫瘤壞死因子的腫瘤微環境中存活。因此,將上述藥物應用于治療高風險OC患者可能具有廣闊的前景。作為前瞻性研究,本研究依然存在一定的局限性,所用數據均來源于在線數據庫,仍需進一步結合大量臨床標本及實驗數據來驗證其臨床應用價值。

綜上所述, 7個OCSS lncRNA構建的OC預后模型有助于預測OC患者預后,而基于模型結果的免疫分析表明,抑制γδT細胞和M1巨噬細胞生長可能是引起OC進展的因素之一。藥物敏感性分析獲取了9種可能對高風險患者具有治療價值的抗癌藥物。